撰文 | 唐小糖
COVID-19大流行已對全球造成了重大的公共衛生安全威脅，同時也引起了前所未有的經濟危機。其病原體人冠狀病毒 SARS-CoV-2的來源及其演化路線和可能的潛在宿主目前仍不清楚。基因組遺傳學分析表明，SARS-CoV-2與蝙蝠冠狀病毒（BatCoV）-ZC45、BatCoV-RmYN02和BatCoV-RaTG13的基因組核苷酸序列的同一性分為別89.1%、93.3%和96.2%，表明SARS-CoV-2極有可能來源於蝙蝠【1-3】。但由於存在自然的生態隔離，BatCoV直接跳躍到人身上的機率很小，所以其他哺乳動物物種很可能充當中間宿主，祖先病毒在中間宿主體內經歷長時間的演化（突變）後，最終獲得了傳染人的能力。
SARS-CoV-2、PCoV和BatCoV-RaTG13的序列對比（來源：參考文獻【5】）
病毒和宿主的物種特異性受體結合是宿主嗜性的主要決定因素，這一相互作用也構建了一個病毒侵染過程的主要物種間屏障【10】。對於SARS-CoV和SARS-CoV-2來說，其S蛋白的RBD識別宿主細胞表面受體ACE2的過程則是宿主範圍、組織嗜性和發病機制的主要決定因素【11】。所以ACE2雖然在各種各樣的脊椎動物中均有表達，但很多動物並不會被感染，如小鼠，這也是為什麼研究者要使用人ACE2轉基因小鼠來作為研究SARS-CoV和SARS-CoV-2的動物模型。此外，雖然已有實驗證據顯示，倉鼠、雪貂、貓、狗以及一些非人靈長類動物（恆河猴、食蟹猴）可以被SARS-CoV-2感染。但SARS-CoV-2的確切宿主範圍仍然不得而知。
2020年4月23日，清華大學丁強團隊聯合復旦大學張榮和袁正宏團隊在預印版bioRxiv上發表了題為「Functional and Genetic Analysis of Viral Receptor ACE2 Orthologs Reveals Broad Potential Host Range of SARS-CoV-2」的研究論文。在哺乳動物中發現了約80個物種的ACE2可能作為SARS-CoV-2進入的功能性受體。通過遺傳學分析，研究人員選取了48個代表性物種（48/80）進行功能性分析。進一步功能測定顯示，有44種哺乳動物（包括家畜、寵物以及動物園或水族館中的動物）的ACE2可以與S蛋白結合，促使SARS-CoV-2進入靶細胞。該研究表明SARS-CoV-2可能具有廣泛的宿主範圍，提示監測易感宿主的重要性。此外，也要警惕其跨物種的潛力，防止未來的疫情發展。
研究人員首先根據SARS-CoV的S蛋白與ACE2的結構基礎，確定了5個高度保守的關鍵胺基酸殘基，這些胺基酸對於S蛋白介導的病毒進入至關重要。根據這5個胺基酸殘基，從 NCBI資料庫包含的294個ACE2同源序列中篩選出了80個來自哺乳動物的 ACE2同源序列。進一步遺傳學分析表明，在狹鼻下目（包括人型總科和舊世界猴子）中，ACE2與S蛋白相互作用表面的20個胺基酸殘基高度保守，而新世界猴子中則相對不保守，如人ACE2中的Y41和Q42被H和E取代，不能形成氫鍵。此外，在非靈長類動物中，胺基酸替代明顯增加。
圖1. 遺傳學分析不同物種ACE2同源序列與S蛋白的相互作用界面
接下來，研究人員選擇了48個具有代表性的ACE2同源序列，包括靈長目（猿類等）、齧齒目（鼠類等）、偶蹄目和奇蹄目（家畜等）、翼手目（蝙蝠等）、雙門齒目（袋鼠、考拉等）、食肉目（老虎、獅子等）、鱗甲目（穿山甲等），在HeLa細胞中異位表達，通過感染SARS-CoV-2來評估其作為受體介導病毒感染的能力。這些動物主要包括野生動物、動物園和水族館中的動物、與人密切接觸的寵物和牲畜以及生物醫學研究中的模型動物等。令人驚訝的是，除了三種新世界猴子（白色簇絨耳狨猴、松鼠猴和簇毛捲尾猴）ACE2不結合S1蛋白，考拉、白鼬ACE2結合有限以外，其餘的44種都可以很好的與S1蛋白結合。以上結果表明，很多物種的ACE2蛋白均可以與SARS-CoV-2的S蛋白相互作用，可能具有介導病毒進入的潛力。
圖2. SARS-CoV-2 S蛋白與不同物種ACE2結合實驗
為了直接測定ACE2介導病毒進入細胞的功能，研究人員直接用 SARS-CoV-2活病毒感染過表達ACE2的HeLa細胞，48h後對病毒N蛋白進行免疫螢光染色。結果與上述S1蛋白與ACE2的結合能力一致，44個物種的ACE2過表達的HeLa細胞中均檢測到了大量的N蛋白陽性信號。而過表達三種新世界猴子和考拉ACE2的細胞中未檢測到信號，過表達白鼬ACE2的細胞則檢測到較低的信號。該結果表明SARS-CoV-2可以利用進化多樣化的哺乳動物ACE2作為病毒進入細胞的受體，暗示SARS-CoV-2可能具有廣泛的宿主範圍。
圖3. 不同物種ACE2介導SARS-CoV-2進入的功能實驗
值得注意的是，雖然ACE2在這些物種間整體保守（71%-100%），但保守程度與支持病毒進入的功能可能不直接相關。例如以上三種不能介導病毒進入的新世界猴子ACE2序列與人ACE2序列的同一性在92%-93%之間，而有效介導病毒進入的豬和牛ACE2序列與人ACE2序列同一性分別為81%和78%。基於此，研究人員合理推測，新世界猴子中的ACE2蛋白某些關鍵的胺基酸殘基替代，限制了病毒的進入。新世界猴子也是一種生物醫學研究常用的非人靈長類動物模型，最近的一項體內研究也表明SARS-CoV-2可以感染舊世界猴子（恆河猴和食蟹猴）而不能感染新世界猴子（狨）【12】。
為了尋找新世界猴子ACE2中限制SARS-CoV-2進入的原因，研究人員分析了ACE2與S蛋白接觸位點，特別是可以與S蛋白形成氫鍵或鹽橋的幾個重要位點。通過與其他物種ACE2蛋白比對，發現新世界猴子ACE2的唯一差異是H41和E42，其他物種ACE2則是Y41和Q42。而41位和42位這兩個連續突變很有可能會破壞原有的氫鍵相互作用，進而損壞了新世界猴子ACE2與SARS-CoV-2的S蛋白的結合。後續研究人員將通過實驗進一步證明這兩個位點的重要性。
圖4. 物種特異性ACE2限制SARS-CoV-2進入的識別
總的來說，本研究首次使用SARS-CoV-2活病毒對近50個哺乳動物宿主的ACE2蛋白進行功能評估，發現了寵物（如貓和狗）、牲畜（如牛、兔、羊、馬）、動物園或水族館的一些動物以及一些野生動物可能作為SARS-CoV-2的潛在宿主，提示在與人密切接觸的動物方面要引起警惕，在野生動物方面更要禁止非法貿易以降低接觸風險。
值得注意的是，由於條件限制，未能開展SARS-CoV-2感染的動物實驗。雖然細胞水平實驗具有一定的局限性，不能充分反映體內複雜的免疫過程。但本研究的證據與目前發現的動物實驗證據或感染案例基本相互印證（如人、猴子（恆河猴和食蟹猴）、穿山甲、倉鼠、雪貂、貓、老虎、獅子、狗可以感染；而小鼠、新世界猴子（狨）不能感染）【1,2,5-7,12-26】。所以本研究仍然為潛在的宿主範圍和跨物種傳播提供了新的見解，此外，研究人員還強調了監測易感宿主的必要性，有助於防止未來的疫情發展。