金屬所在醫用金屬材料的生物功能化研究上取得多項成果

    醫用金屬材料以其高強韌性、耐疲勞、易加工成形性等優良的綜合性能，一直是臨床上用量最大和應用廣泛的一類生物醫用材料。醫用金屬材料是需要承受較高載荷的骨、齒等硬組織以及介入治療支架的首選植入材料，已大量應用於骨科、齒科、介入治療等重要醫療領域中的各類植入醫療器械。目前醫用金屬材料中用量最大、應用範圍最廣的是不鏽鋼、鈦及鈦合金、鈷基合金三大類材料，在醫用金屬材料的生產和臨床應用中佔有舉足輕重的地位。此外還有鎳鈦形狀記憶合金以及金、銀、鉭、鈮、鋯等貴金屬。

    然而，目前臨床應用的醫用金屬材料在生物體中一般表現為生物惰性，不具備生物活性，因此往往需要通過對其進行表面改性，來達到具備一定生物活性，進而提高其臨床使用性能的目的。那麼能否使醫用金屬材料自身就具備某種生物活性呢？至今還未有這方面的研究報導。醫用金屬材料的生物功能化就是希望解決這一重要問題，因而它是一個具有創新意義和挑戰性的新概念，其核心思想就是使醫用金屬材料在發揮其自身優異力學性能的同時，還具備特定的生物醫學功能，從而達到更佳的臨床醫療效果。中科院金屬研究所研究員楊柯領導的生物材料研究團隊近年來進行了多方面的嘗試，已經初步實現了特定醫用金屬材料的生物功能化，並將這一新思想發表在近期的Journal of Materials Science and Technology上（Bio-functional Design for Metal Implants, a New Concept for Development of Metallic Biomaterials, Ling REN, Ke YANG, JMST. 2013, Vol. 29, 1005-1010）。

　　人們知道，人體中存在有多種不同種類的金屬元素，如：宏量金屬元素K、Na、Ca、Mg，微量金屬元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、Cr、Sn、V、Ni等，它們在人體中都會發揮不同的生物功能。如果人體中缺失那種金屬元素，可能就會引發某種疾病；如果在人體中適量補充某種金屬元素，可能會有助於治癒一些疾病。事實上，醫用金屬材料在人體環境中（無論是體液，還是血液）都會發生不同程度的腐蝕現象，從不鏽鋼、鈦及鈦合金、鈷基合金等金屬材料的極緩慢腐蝕，到目前熱點研究的鎂基金屬的快速腐蝕直至完全降解吸收。因此就可以利用醫用金屬材料在人體環境中不可避免發生腐蝕的特性，通過特定的合金化設計和製備，在現有醫用金屬材料中添加某種具有生物醫學功能的特定金屬元素，利用金屬在體內發生腐蝕而造成的這種特定金屬元素的持續釋放現象，在滿足生物安全性的前提下，在實現植入金屬力學支撐作用的同時，額外發揮這一特定金屬元素的生物醫學功能，從而賦予醫用金屬材料特定的結構/生物醫學功能一體化特性。這是一個極富挑戰性的創新設想，具有重要的臨床應用價值，國際上還未見有人提出相同的思想及相關的研究報導。實現醫用金屬材料的結構/生物醫學功能一體化的關鍵在於針對臨床應用目標的材料設計、製備及性能調控，其應在保持現有同類醫用金屬材料各項性能水平的基礎上，通過特定金屬元素的持續溶出，而達到兼有力學承載能力和生物醫學功能的雙重目的。

　　在眾多金屬元素中，銅的生物學作用逐漸得到人們的認可。銅離子是人體中必需的微量金屬元素，它的殺菌作用很早就被廣泛認可。銅離子對心血管系統具有重要的作用，不僅可以抑制血栓的形成，還能抑制動脈平滑肌的過度增殖、變性等病變，並且能夠促進血管內皮再生。近期有醫學研究表明，無論是在體外還是在動物體內，Cu₂SO₄溶液中的銅離子均能明顯地促進骨膠原的沉積。由於骨膠原能促進鈣、磷等無機物質在骨上的沉積，因而能起到修復骨組織、促進骨再生、改善骨質疏鬆症狀等有益作用。此外，還有醫學研究發現，微量銅離子可促進人體組織中的血管化過程，這對人體組織的修復過程具有至關重要的作用。

　　楊柯領導的研究團隊近年來研究開發出的系列含銅抗菌不鏽鋼為上述嘗試奠定了材料基礎。所謂含銅不鏽鋼，是指在現有醫用不鏽鋼（304、316L、317L等）的成分基礎上，通過加入適度過飽和量的銅元素，經過固溶+時效的熱處理，使其基體中均勻彌散地分布有納米尺度富銅析出相的新型不鏽鋼。這種含有富銅相的含銅不鏽鋼在人體環境中由於不可避免地會發生一定的腐蝕，因而可以微量和持續地向周圍組織中釋放出銅離子，從而發揮出銅離子的諸多有益的生物醫學功能。因此，含銅不鏽鋼巧妙地將不鏽鋼的優異的力學性能、耐蝕能力與銅離子的生物醫學功能相結合。根據醫用金屬材料生物功能化這一全新的概念，研究團隊開展了含銅不鏽鋼（316L-Cu和317L-Cu）抑制細菌感染、降低支架內再狹窄、促進成骨等生物醫學功能的研究探索工作。

　　圖1分別為利用掃描電鏡對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在骨科植入常用的317L不鏽鋼和317L-Cu含銅不鏽鋼表面上的細菌生物膜形成過程的觀察結果。圖中大腸桿菌呈杆狀，金黃色葡萄球菌呈球狀。從圖2中可以看到，317L不鏽鋼的表面上粘附有大量的細菌，並且隨著與細菌共培養時間的增加，細菌數量越來越多，形成的細菌生物膜面積和厚度越來越大。當時間達到24h時，可以看到317L不鏽鋼表面上形成的細菌生物膜已經呈現多層立體結構。然而，317L-Cu不鏽鋼表面上的細菌數量非常稀少，其隨意和零星地分布在不鏽鋼表面上，而且即使增加與細菌的共培養時間，也沒有發現形成細菌生物膜。由此可見，含銅不鏽鋼具有的強烈和廣譜殺菌功能，能夠有效抑制在其表面上形成細菌生物膜。

　　外科植入物引發的細菌感染是目前亟待解決的重要臨床問題，而抗生素的過量使用已經帶來了諸多隱患（如使細菌產生抗藥性、形成超級細菌等），因此能夠從植入物材料入手來降低或抑制細菌感染的發生將具有重要的臨床應用價值。臨床醫學研究表明，在植入物表面形成細菌生物膜是引發細菌感染的主要原因。由以上研究結果可知，由含銅不鏽鋼製作的外科植入物產品應具有抑制細菌感染的生物醫學功能，具有廣泛的臨床應用前景。在體外實驗研究的基礎上，將含銅不鏽鋼製作成骨、齒固定螺釘，蘸上菌液後植入動物體內進行驗證。動物植入實驗研究結果表明，與普通不鏽鋼螺釘相比，含銅不鏽鋼螺釘周圍組織中的細菌濃度明顯下降，無細菌感染現象發生。在此創新思想指導下，還相繼開發出含銅抗菌鈦合金、含銅抗菌鈷基合金等醫用金屬新材料。含銅抗菌金屬的醫學應用屬於國際首創，在申報了數項國家發明專利的基礎上，研究結果已發表在Journal of Materials Science: Materials in Medicine、Materials Science and Engineering C、Colloids and Surfaces B: Biointerfaces等多個國際相關學術刊物上。目前，研究團隊正在與國內相關生產企業合作開發具有抗感染功能的不鏽鋼骨科、齒科植入物新產品。

　　心血管支架植入是目前治療冠脈狹窄的一種有效方法，已經得到廣泛的臨床應用。然而支架植入後引發的冠脈再狹窄現象（稱為支架內再狹窄，in-stent restenosis - ISR）是目前臨床上亟待解決的重要問題。雖然近年來臨床應用的帶藥支架能夠部分地降低ISR的發生率，但其造成的遠期再狹窄又是一個新的臨床問題。臨床研究表明，支架植入後引發的急性血栓以及血管平滑肌的過度增生是ISR發生的兩個主要原因，而加快血管內皮化會降低急性血栓的發生。已有醫學研究報導，微量銅離子既可降低凝血傾向，有利於抑制血栓形成，又能抑制血管平滑肌細胞（VSMC）的增殖，但促進血管內皮細胞（VEC）的增殖，從而有利於血管的內皮化過程。銅元素的這些影響都會有助於降低ISR的發生率。 

　　316L不鏽鋼已廣泛用於製造心血管支架，如果在316L不鏽鋼中添加適量銅，而使其在血液環境中微量和持續地釋放銅離子，從而發揮銅離子對心血管系統的上述諸多有益作用，就可能從心血管支架用材料方面達到有效降低ISR發生率的目的，這是醫用金屬材料生物功能化的又一項有意義的嘗試。研究團隊完成的大量和不同內容（細胞粘附、細胞凋亡、細胞遷移等）的體外研究結果都給予了有利的驗證，例如：與316L不鏽鋼相比，VSMC在316L-Cu含銅不鏽鋼表面上的粘附量明顯降低（見圖2（a）），在316L-Cu不鏽鋼浸提液中的凋亡率增大、遷移能力明顯下降，表明含銅不鏽鋼中的微量銅離子釋放具有抑制血管平滑肌的過度增生的生物功能。而與此同時，316L-Cu不鏽鋼卻有助於VEC的增殖（見圖2（b）），提高細胞的遷移能力，從而會加快血管的內皮化過程。血小板粘附、動態凝血等實驗結果表明，316L-Cu不鏽鋼具有更優異的抗凝血性能，從而會有利於降低血栓形成傾向。以上體外實驗研究結果表明，316L-Cu不鏽鋼應自身具有降低ISR發生率的生物醫學功能，有望成為心血管支架用新一代不鏽鋼植入材料。目前研究團隊已經加工出316L-Cu不鏽鋼心血管支架，與臨床醫院合作，正在進行相關的動物植入實驗研究。相關研究成果已經申報國家發明專利，並發表在Journal of Materials Science: Materials in Medicine上。

　　骨科植入材料通常希望具有良好的與骨組織結合能力，從而實現與骨組織更加牢固的結合。由於現有金屬植入材料一般表現為生物惰性，因此往往是通過表面改性來提高其骨結合能力。但由於表面改性塗層材料通常是陶瓷、高分子等非金屬材料，塗層與金屬基體的結合力往往較差，塗層在使用過程中極易脫落，很難達到預期效果。如果能夠賦予金屬植入材料表面一定的生物活性，將會具有重要的臨床應用價值。近期有醫學研究證實，微量的Cu離子能有效地促進骨膠原沉積，並具有促進骨組織中的血管再生功能，因而會有助於成骨過程。因此，以醫用金屬材料的生物功能化為指導思想，對含銅不鏽鋼對成骨過程的影響進行了探索性研究，取得了創新性的研究進展。 

　　將小鼠成骨細胞MC3T3 E1分別與317L不鏽鋼、317L-Cu含銅不鏽鋼共培養3、7天后發現，在317L-Cu不鏽鋼表面上的骨細胞伸長明顯增大，細胞的平均面積也明顯增大，且代表骨細胞增殖能力的鹼性磷酸酶（ALP）的表達明顯增高，說明骨細胞更適於在含銅不鏽鋼表面上粘附和生長，反映出含銅不鏽鋼表面微量釋放銅離子的有益生物功能。此外，從Real time-PCR實驗結果也看出，多種代表成骨的基因表達顯著上調，進一步證明含銅不鏽鋼應具有促進成骨作用。隨後的動物體內植入實驗研究結果表明，植入動物骨內15天后，與317L不鏽鋼相比，317L-Cu不鏽鋼可明顯提高其周圍組織的骨密度和骨量，植入物從骨內的推出力明顯增大，表明與骨組織的結合力增高。由此可見，含銅不鏽鋼會明顯促進早期成骨過程，表現出一定的表面生物活性，這在現有臨床應用的醫用金屬材料中是從未發現過的。有關上述研究結果已經整理成文章，希望早日刊出發表。 

　　醫用金屬材料的生物功能化設想的另一有意義的嘗試就是生物可降解鎂基金屬。生物可降解鎂基金屬（包括純鎂和鎂合金）是極具挑戰性和革命意義的新型醫用金屬材料，是近年來醫用金屬材料的研究熱點，在骨科、心血管支架領域中具有重要的應用前景。利用鎂基金屬在生理環境降解過程中原位產生的高鹼性和高的鎂離子濃度，以及得到證實的促進成骨作用，研究團隊發現了鎂基金屬植入產生的多種生物醫學功能，具有獨特的創新性和臨床應用價值。研究發現：（1）將鎂基金屬植入到骨質疏鬆模型的動物體內後，由於在降解過程中鎂離子的原位釋放，可明顯恢復甚至提高骨質疏鬆動物骨組織的骨密度，升高其體內的骨形成蛋白（BMP-2）的表達（見圖3），因此具有較好的防治局部骨質疏鬆症的生物功能；（2）鎂基金屬在降解過程中產生的局部高鹼性，具有強烈的抗菌功能（見圖4）。將鎂植入到骨髓炎模型的動物體內後，可明顯抑制細菌的繁殖，具有治療骨髓炎的潛在應用前景；（3）鎂基金屬在降解過程中產生的局部高鹼性，對多種惡性腫瘤細胞具有較強的殺滅作用，可望防止腫瘤切除後的原位復發，進而在骨腫瘤切除後的骨填充修復中得到臨床應用。相關研究結果已經發表在Journal of Biomedical Materials Research: Part A、Materials Letters、Materials Science and Engineering C、Journal of Materials Science: Materials in Medicine、Journal of Materials Science and Technology等期刊上。 

　　利用對人體有益金屬元素的適量釋放而實現醫用金屬材料的生物功能化是一項有創新意義、臨床應用價值和挑戰性的研究方向，其最終目標是使廣大患者從中受益，並提高我國相關醫療器械產品的國際市場競爭力。 

圖1 317L不鏽鋼和317L-Cu不鏽鋼分別與大腸桿菌（E. coli）和金黃色普通球菌（S. aureus）共培養6、12、24小時後，表面形成細菌生物膜的SEM形貌觀察。

（a）VSMC在不鏽鋼表面上的形貌

（b）VEC形貌在不鏽鋼表面上的形貌

圖2 VSMC（a）和VEC（b）分別與不同不鏽鋼共培養24h、72h後，在不鏽鋼表面上的粘附照片。

圖3 不同實驗組的BMP-2表達，Mg+Os = 在骨質疏鬆模型大鼠中植入鎂合金4周，Control = 正常大鼠對照，Os = 骨質疏鬆模型大鼠。

圖4 317L不鏽鋼和純鎂分別與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌共培養後的殺菌效果照片。