非核糖體肽合成酶（Nonribosomal peptide synthases，NRPSs) 是一類結構獨特且功能多樣的多模塊巨型酶，能夠對底物胺基酸進行特異地選擇並按一定的順序合成非核糖體肽。每個模塊通常包含三個必需結構域即腺苷醯化 (A) 結構域、肽醯載體蛋白 (PCP) 結構域和縮合 (C) 結構域，負責將特定的單體縮合到新生成的肽鏈上【1】。其中某些非核糖體肽的N端帶有脂肪酸鏈，稱為非核糖體脂肽，通常具有廣泛的生物活性，如鏈黴菌來源的達託黴素和類芽孢桿菌來源的多粘菌素被認為是對抗革蘭氏陽性菌和陰性菌感染的最後一道防線，而芽孢桿菌來源的表面活性素則是目前已知活性最強的生物表面活性劑【2，3】。脂肪酸與聚肽鏈N端胺基酸的縮合一般是由起始縮合 (Cs) 結構域催化的，脂肪酸需要首先活化成輔酶A或醯基載體蛋白 (ACP) 形式，才能啟動非核糖體脂肽的生物合成【4】。
脂肽的N端脂肪酸鏈可以進入細菌細胞膜的磷脂雙分子層,對脂肽的生物活性和毒性都有重要的影響【5】，因此改變脂肪酸鏈可提高脂肽成藥屬性，如達託黴素的創製。目前非核糖體肽聚肽骨架的組合生物合成研究取得顯著進步【6】，但卻少有利用遺傳操作對非核糖體脂肽的脂肪酸鏈進行改造的研究，究其原因是對Cs結構域裝載脂肪酸鏈的特異性尚不明確【7】。
2021年1月12日，山東大學微生物技術重點實驗室卞小瑩課題組、武大雷課題組和張友明課題組聯合在Nature Communications上在線發表了題為Engineering andElucidation of the Lipoinitiation Process in Nonribosomal Peptide Biosynthesis」的研究論文，該研究首先發現改造Cs結構域（結構域替換或點突變）能夠改變非核糖體脂肽rhizomide，holrhizin和glidobactin的脂肪酸鏈，確立了一種改變脂肽脂肪酸鏈的策略。首次獲得並解析了Cs結構域突變體（RzmA-Cs R148A）與其供體底物辛醯輔酶A的共結晶結構，鑑定了一系列控制脂肪酸鏈選擇性的關鍵胺基酸位點，使得rhizomide的醯基鏈由乙醯基延長至十六烷醯基。而且，該研究闡明了在非核糖體脂肽的脂鏈啟動過程中Cs結構域的三種不同構象，提出了此結構域 「從底物結合到產物釋放」的動態結構變化模型。該研究為非核糖體肽的脂鏈啟動機制和工程化奠定了理論和實踐基礎。
前期研究從同一株伯克氏菌Paraburkholderia rhizoxinica中發現了兩類含有不同長度脂肪酸鏈的脂肽rhizomide和holrhizin 【8，9】。它們負責脂肪酸裝載的Cs結構域顯示了很高的同源度，但是裝載脂肪酸鏈的長度卻有較大差異 (C2 vs C8)。因此提供了一個可用於研究脂肪酸底物特異性的理想模型。作者首先利用Cs結構域交換發現能夠成功改變前述兩類脂肽的脂肪酸鏈，說明Cs結構域具有較高的脂肪酸鏈特異性，並因此確立了一種改變脂肽的脂肪酸鏈的遺傳學方法，即全長Cs結構域交換定向改造脂肽的脂醯基鏈。並將該方法應用了來源於Schlegelella brevitalea strain DSM 7029的脂肽glidobactin A（原始為帶兩個不飽和雙鍵C12脂醯基的產物），將其與同源的glidopeptin合成基因簇的全長Cs以及前述異源的holrhizin的全長Cs進行交換後，均獲得了高產的衍生物，證明了方法的有效性和普適性。
圖1非核糖體脂肽的生物合成以及利用Cs結構域替換改變rhizomide、holrhizin和glidobactin的脂肪酸鏈結構。
隨即經過序列比對發現了一個關鍵的胺基酸位點R148，通過突變實驗發現該胺基酸對脂肪酸鏈的長短具有決定性的作用。然後對RzmA-Cs結構域進行體外表達，並測試了該結構域及突變體與不同脂醯輔酶A的結合能力，成功獲得了Cs結構域與供體底物辛醯輔酶A的共結晶結構（圖2），在此基礎上，結合關鍵位點的胺基酸突變（Q36，Y138，R148，Q136和M143），闡釋了Cs結構域對脂肪酸鏈的選擇機制，並進一步確定了負責脂肪酸鏈長度的其它關鍵胺基酸。對rhizomide而言，其Cs結構域中起決定性作用的胺基酸為Q36，Y138，R148，起輔助作用的胺基酸為Q136及M143，其中R148位於結合口袋的入口位置，為第一個關鍵胺基酸，Q36，Y138以及輔助位點Q136，M143均位於口袋內部。對口袋入口及進一步的口袋內部相應胺基酸的操縱，可以實現對脂肽脂醯基鏈的定向改造，在體內突變試驗中也同步實現了rhizomide的脂肪酸鏈長度從乙醯基到十六烷醯基（C2 - C16)的巨大改變，產生並鑑定了一系列的非天然脂肽。綜上所述，該研究通過Cs結構域替換和關鍵胺基酸突變這兩種手段對產物脂肽的脂肪酸鏈進行操縱，為非核糖脂肽的脂肪酸鏈改造提供了可行的策略和較為普適的方法，為複雜脂肽的組合生物合成和工程化改造奠定了理論和實踐基礎。本研究首次通過遺傳改造(結構域替換和點突變)實現了非核糖體脂肽脂鏈的大幅改變，確立脂肽工程化改造的新策略，為複雜脂肽藥物的研發提供了新的改造手段和策略。
圖2 Cs結構域與供體底物辛醯輔酶A的複合物結構（a）顯示控制脂肪酸鏈長度的關鍵胺基酸（b），並通過體外（c）和體內（d）實驗改變改變脂肪酸長度。
作者同時也獲得了Cs結構域與供體底物辛醯輔酶A及受體底物胺基酸（L-Leu-SNAC）的三元複合物結構（圖3），發現反應中心組氨酸H140對兩底物均具有穩定定位的作用，為Cs結構域的工程改造提供了重要信息。同時基於獲得的多種不同構象Cs結構域的精細結構，提出其在催化脂鏈起始過程中存在的「從底物結合到產物釋放」動態結構變化模型，進一步揭示了Cs結構域的催化機理。本研究首次闡釋了Cs結構域在脂鏈起始中的獨特構象變化，清晰地揭示了該結構域識別和催化兩個底物的反應循環，完整闡明了非核糖體肽的脂鏈起始過程。
圖3 Cs結構域與供體底物辛醯輔酶A及受體底物胺基酸（L-Leu-SNAC）的三元複合物結構（a,b）和Cs結構域的底物釋放後的構象狀態與未綁定底物的構象狀態比較（c），以及Cs結構域催化脂鏈起始過程中存在的「從底物結合到產物釋放」動態結構變化模型（d）。
原文連結
https://www.nature.com/articles/s41467-020-20548-8
參考文獻
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來源：BioArt
原標題：《【學術前沿】卞小瑩/武大雷/張友明組合作首次工程化改造和闡明非核糖體肽的脂鏈啟動過程》
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