「真菌王國科普系列之六」真菌基因編輯基礎——遺傳轉化

2020-12-06 中國科學院微生物所

本文作者：竇凱琦 段成寶

編輯排版：張日鵬

在我們的生活中，微生物時時刻刻伴隨著我們，它們看不見摸不著，甚至容易讓大家忽略它們的存在。2019年末，新冠病毒引起的肺炎疫情爆發，讓微生物這個群體重新引起人們的重視。

微生物包括細菌、真菌、病毒以及少數藻類等，微生物群體千姿百態，有益也有弊。在過去幾千年裡，人們一直與微生物鬥智鬥勇，甚至一段時間將一些微生物造成的疾病歸為天災神論。作為微生物中重要的成員，真菌種類繁多，是僅次於昆蟲的第二大生物類群。真菌與人們的生活息息相關，在自然界中負責有機物質的分解。此外，大型子實體真菌可以食用，有一些還可以入藥。

1928年英國科學家弗萊明在點青黴菌中發現了具有抑制金黃色葡萄球菌的活性物質——青黴素，拉開了人們使用抗生素對抗細菌性感染疾病的序幕。目前臨床上廣泛使用的青黴素、降血脂藥物洛伐他汀、以及免疫抑制劑環孢菌素等均來自真菌次級代謝產物或衍生物。進入新世紀以來，真菌中發現的活性天然產物已成為微生物活性化合物的主要來源。

自然界中的真菌（圖片來源於網絡）

隨著越來越多真菌基因組測序的完成，為我們從分子水平上揭示基因的功能提供了條件。然而由於真菌基因組相對較大，細胞結構複雜，大部分真菌缺乏有性階段，基因操作困難，嚴重阻礙了真菌遺傳學的研究。因此有必要建立和完善真菌的遺傳轉化系統，為基因功能研究提供便捷的技術手段。

建立真菌的遺傳轉化系統，首先需要向真菌細胞中導入遺傳物質。目前真菌中DNA的導入方式主要包括聚乙二醇（PEG）介導的原生質體轉化法、電激轉化法、轉座子法、基因槍法、限制酶介導法、農桿菌介導法等。

PEG介導的原生質體轉化方法首先需要通過酶法獲得原生質體，然後在PEG誘導下促進原生質體吸收外源DNA，鈣離子增加細胞膜通透性。儘管很多真菌都可以採用這種方法進行轉化，但由於不同真菌細胞壁結構的差異，轉化效率相差很大，尤其是對於大型真菌（如靈芝）的轉化效率很低。

電激轉化法是利用高壓脈衝作用，在真菌質膜上形成可修復的瞬時通道，使外源DNA進入受體細胞，環狀DNA較線性DNA轉化效率稍高。

轉座子是染色體或質粒上一段可移動的DNA片段，可以從一個位置跳躍到另一個位置。但這種轉化方法適用範圍很局限，並不是所有真菌中都存在轉座子，且其不穩定性和隨機性也無法滿足詳細的基因分析。

基因槍法又稱微彈技術。外源DNA包裹在微小的金粒或鎢粒上，在高壓下高速射入真菌細胞。基因槍法簡單，轉化時間極短，但受真菌細胞大小影響以及成本造價都限制了該方法的應用。

限制酶介導法是將限制性內切酶及其切割的DNA片段導入真菌細胞，限制性內切酶作用於基因組並產生與DNA片段相同的粘性末端，目標DNA片段整合到基因組上。相對於前面幾種轉化系統，限制酶介導法只能通過基因插入產生突變。

農桿菌介導法是利用農桿菌Ti質粒上Vir基因家族的表達，將T-DNA及外源DNA一起整合至真菌細胞基因組上。相比於其他轉化方法，可用該方法進行遺傳轉化的真菌種類較多，轉化效率相對較高，且轉化子穩定。

在人工核酸基因操作領域，最有名的基因編輯方法是 CRISPR/Cas9 技術。CRISPR/Cas是細菌和古細菌在進化過程中形成的一種獲得性免疫系統，在對抗外來 DNA 的適應性免疫系統中起著重要的生物學作用，主要是針對噬菌體和病毒侵染的一種防禦機制。CRISPR/Cas 系統的出現徹底改變了生物學的研究，目前在諸多領域內發展了許多創新性的應用，在真菌的遺傳學研究和工業應用中表現出巨大的潛力。

精準基因編輯（圖片來源於網絡）

真菌遺傳轉化系統的建立和完善為特定基因的功能以及代謝及調控研究提供了技術支持，也為真菌菌株的定向遺傳改造提供了條件。研究人員可以通過簡單插入/刪除/敲低等策略來確定一個基因的功能，從而研究與功能以及與其相關的調控或互作機制，並可按照生產實踐的需求對工程菌株進行定向改造和優化，使真菌更好地為人所用。

參考資料：

[1]黃亞麗,葉婧,蔣細良,朱昌雄.真菌遺傳轉化系統的研究進展[J].微生物學通報,2007(06):1213-1217.

[2]趙美,王陳驕子,周而勳,舒燦偉.絲狀真菌遺傳轉化系統的最新研究進展[J].基因組學與應用生物學,2019,38(03):1138-1143.

[3]De-Groot M , Bundock P , Hooykaas P , et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi (published erratum appears in Nat Biotechnol 1998 Nov;16(11):1074)[J]. Nature biotechnology, 1998, 16(9):P.839-842.

[4]Marraffini LA. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes[J]. Nature, 2015, 526(7571):55-61.

部分圖片來源於網絡

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