2017年9月21日，美國生物技術公司Alnylam宣布其RNAi藥物Patisiran在一個家族性澱粉樣多發性神經病變(FAP)三期臨床達到一級、二級終點，這是RNAi藥物首次在三期臨床達到主要臨床終點。這個名為Apollo的試驗招募225名患者，使用18個月一級終點mNIS+7和二級終點Norfolk QoL都顯著下降，顯示該藥物不僅減緩疾病惡化，還可能逆轉疾病。用藥組和安慰劑組退出率分別為7.4和37.7%，也說明用藥組療效顯著。兩組死亡率分別為4.7%和7.8%，但似乎未達到統計顯著。最重要的是Patisiran似乎沒有遇到困擾RNA藥物的安全性問題，具體數據要在11月的會議公布。受此消息影響ALNY股票當天上揚52%，而競爭對手Ionis下滑9%。
RNAi及相關藥物簡介
Mechanism of RNA interference and miRNA in mammalian cells
RNA幹擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。RNAi是在研究秀麗新小杆線蟲(C.elegans)反義RNA (antisense RNA)的過程中發現的，由dsRNA介導的同源RNA降解過程。此後dsRNA介導的RNAi現象陸續發現於真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，並逐漸證實植物中的轉錄後基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介導的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)現象均屬於RNAi在不同物種的表現形式。由於使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用於探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。
2004年9月，《自然》首次刊登了美國科學家Andrew Z. Fire與Craig C. Mello等人撰寫的關於RNA幹擾的成果文章。時隔不久，RNAi技術取得了非凡的成就。人們逐漸意識到，RNAi將會對生物學的發展帶來深遠的影響。毫無疑問，打開了RNAi這一潘多拉盒子的Andrew Fire與Craig Mello獲得了2006年的生理學或醫學諾貝爾獎。諾貝爾委員會成員Goran Hansson在該年的頒獎詞中說道：「RNAi為我們了解生命提供了新視角，並為醫學發展提供了新工具。」
Chemical modifications of siRNAs
對於基於核苷酸的藥物而言，其在體內發揮作用的最大障礙在於核酸酶的降解作用及內吞過程中藥物分子從內吞體的逃逸。通過化學修飾，如增加2』甲氧基及LNAs等技術，可以提高藥物分子的穩定性，延長其半衰期。除了通過化學修飾增加穩定性外，膠囊技術的拓展，也可以提高藥物分子的輸送效率。常用的輸送系統包括脂質納米粒，如中性脂肪乳劑或靶向部分連接的樹狀大分子複合物。對於藥物輸送系統，最大的挑戰性在於潛在的免疫刺激作用及對病變區域靶向特異性的缺失。
Comparison of RNAi drug with two major classes of traditional pharmaceutical drugs—small molecules，and proteins and antibodies
相比於傳統的小分子藥物及蛋白類藥物，RNAi類藥物具有自身獨特的優勢，如上圖所示。RNAi類藥物可以做用於所有的靶點，包括一些目前認為不具有成藥性的靶點，且先導分子能夠被快速的確認和進行優化。對於小分子藥物而言，最大的挑戰在於如何找到具有高度選擇性及治療活性的化合物；這是一個耗時耗力的過程，並且對於很多靶點而言，成功遙不可期。而在RNAi藥物開發領域，確定具有高度選擇性和抑制活性的序列變得非常迅速高效，這一點已在很多藥物靶點上得到了驗證。而對於蛋白及抗體類藥物而言，主要的技術挑戰在於生產過程。對於蛋白類藥物，細胞級別的生產往往得率較低，且蛋白本身往往會出現聚集變性等過程。與之相反，目前siRNAs可以通過化學合成方式獲得，過程簡單。另外，受限於作用原理，RNAi類藥物只能是某些特定靶點的抑制劑，而小分子藥物、蛋白類藥物及抗體類藥物既可以發揮抑制劑作用，又可以作為激活劑形式出現。總而言之，RNAi類藥物是一類新穎的藥物開發策略，有望成為現有藥物體系的一類很好的補充。
本文即對目前進入臨床2-3期研究的代表性RNAi藥物做一簡要綜述，同時還包含了用於HCV治療的miRNA類藥物Miravirsen。上述以RNAi為主的寡核苷酸類藥物的研發，有望為藥物治療市場開闢一片新天地。
部分RNAi類藥物研發進展
Patisiran (ALN-TTR02)
2017年9月21日，ALNY (Alnylam Pharmaceuticals，Inc)製藥公司和賽諾菲共同宣布，治療遺傳性hATTR澱粉樣變性RNAi (RNA幹擾)藥物Patisiran到達主要有效終點以及所有次要終點，圓滿完成名為APOLLO的臨床III期試驗。
家族性澱粉樣多發性神經病變(FAP)是一種罕見的遺傳缺陷，可導致破壞神經的致命蛋白累積。這個病不僅嚴重影響生活質量，而且也致死性很高，診斷後生存期低於15年。其中最常見的致病蛋白為甲狀腺素運載蛋白(Transthyretin，TTR)。TTR有可能在神經、消化道、心臟和眼睛等地方累積。該疾病目前治療方法非常有限，由於TTR大部分是經由肝臟而生成，因此在疾病早期可採用肝移植手術。這種疾病很難用傳統藥物控制，而RNA藥物如Patisiran和Ionis的反義核酸(ASO)藥物NEURO-TTR可以選擇性降解TTR的mRNA避免毒性蛋白的合成。
Timeline of access to anti-amyloid therapies for patients with hereditary transthyretin amyloidosis with polyneuropathy
APOLLO臨床III期試驗是一項隨機、雙盲、安慰劑對照的全球研究，旨在評估Patisiran對遺傳性hATTR澱粉樣變性患者治療的有效性和安全性。這項試驗中，接受Patisiran治療患者在治療的第18個月時達到mNIS+7 (modified neuropathy impairment score，改良神經病變評分)。mNIS+7是一種通過評估感覺運動能力、神經傳導、反射和自主功能評價神經損傷程度的的綜合測量方法。這項研究的次要終點包括Norfolk QOL-DN生活質量評分、NIS-W運動強度評分、R-ODS殘疾評分、10米步行測試、mBMI營養狀況評分以及COMPASS-31自主狀況評價。這項研究的探索性終點包括心功能改善程度、皮膚火箭檢測澱粉樣沉積以及神經纖維密度測量。在這項試驗中，除了達到mNIS+7的主要終點外，接受治療的患者也達到了預期的次要終點和探索性終點。
Alnylam Pharmaceuticals-Clinical development pipeline
基於這些積極的結果，Alnylam預計將於2017年底提交首個新藥申請，並在不久後推出營銷授權申請。從2018年上半年開始，Sanofi Genzyme目前正準備向日本、巴西和其他國家提交Patisiran的監管文件。在獲得監管部門批准後，Alnylam將在美國，加拿大和西歐商業化Patisiran，而Sanofi Genzyme將在世界其他地區商業化該藥物。
Pipeline of Quark Pharmaceuticals，Inc
Quark製藥公司是一家致力於晚期臨床階段研究的製藥公司，在發現和開發新型的基於RNAi療法的藥物研發中處於領先地位。公司有兩類藥物，QPI-1002和QPI-1007被授予孤兒藥地位，目前正在開展全球三期臨床研究，其適應症分別為移植腎功能延遲恢復(DGF)和非動脈炎性缺血性視神經損害(NAION)；PF-655處於臨床二期研究階段。
PF-04523655 (PF-655)
是一類合成的化學修飾後的siRNA，能夠抑制Quark公司獨有的靶點基因RTP801，後者為應激誘導的結構蛋白，可以抑制mTOR信號通路中TSC1/TSC2複合體上遊的各項功能。靶點基因RTP801由Quark公司通過其BiFARTM靶點發現平臺所發現。在缺血、缺氧或氧化應激壓力下，RTP801的表達量會迅速上調。在雷射誘導的脈絡膜新生血管(CNV)的臨床前動物模型玻璃體腔中注射PF-655會導致RTP801表達量因RNAi過程而發生的下調，並且沒有TLR信號的激活、抗血管生成和神經營養因子的誘導表達，以及隨後的脈絡膜新生血管體積減少、血管滲漏和炎性細胞浸潤為脈絡現象的緩解。
PF-655的作用機制被認為與各類型的VEGF抑制劑類藥物不同。對於動物模型中的脈絡膜新生血管，當PF-655與VEGFR抑制劑聯用時，能夠提高效果並降低糖尿病小鼠視網膜中的血管滲漏。在RTP801基因敲除小鼠受氧誘導的視網膜病變模型中也觀察到了在視網膜和視網膜新生血管形成減少，外核層細胞凋亡的衰減(早產兒視網膜病變)。病理過程的緩解同樣出現在各種非眼部疾病模型的RTP801基因敲除小鼠中，包括香菸煙霧誘導的肺損傷和肺氣腫，表明RTP801在急性和慢性應激性病理過程中具有更廣泛的生理功能。
PF-655已進行了多項臨床研究，包括針對糖尿病黃斑水腫(DME)的兩項二期臨床研究，以及用於治療年齡相關性黃斑變性(AMD)的臨床一期/二期研究。在代號為MONET用於治療溼性年齡相關性黃斑變性的二期臨床研究中，相比於前三個月，PF-655可顯著改善平均視力水平；而該藥物同Ranibizumab的聯用效果比單獨用藥更佳。在代號為DEGAS用於治療糖尿病黃斑水腫的二期臨床研究中，相比於雷射光凝治療的對照組，PF-655對於患者視力的改善具有藥物劑量依賴性。基於此項研究的結果，特別是視力改善與藥物劑量間的相關性，一項Ⅱb期研究正在開展用以評估PF-655單獨用藥及與Ranibizumab聯合用藥對DME患者的治療效果。
QPI-1002 (I5NP)
一類靶向於p53基因的siRNA類藥物，也是第一個用於人體全身給藥的siRNA藥物。QPI-1002是一類合成的雙鏈RNA寡核苷酸，對核酸酶具有抗性，設計用來通過RNA幹擾的方式暫時抑制p53基因的表達。該藥物的設計理念最早由Quark提出，其原理基於治療性目的對p53基因的表達進行暫時及可逆性的抑制。p53是由DNA損傷、缺氧、氧化應激等條件激活的應激反應基因，誘導細胞周期阻滯、細胞衰老或凋亡。在急性損傷時，p53的暫時性抑制可減輕程序性細胞死亡，這可能有助於修復細胞損傷，從而保護組織和器官的完整性和功能。採用siRNA方式靶向p53基因的系統治療方案，能顯著改善多種臨床前模型中的急性腎損傷，包括腎血管蒂鉗、部分主動脈鉗、順鉑誘導的急性腎損傷模型和腎移植的冷、冷缺血模型。
QPI-1002目前開展的臨床研究包括用於預防死亡捐獻者腎移植患者出現的移植腎功能延遲恢復(DGF)的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，以及心臟手術後急性腎損傷的兩項臨床Ⅰ期研究。該藥物目前已經獲得美國FDA及歐洲EMA的孤兒藥認定，並且DGF適應症獲得了美國FDA的快速通道指定。針對預防和改善移植腎功能延遲恢復適應症，Quark目前正招募患者開展Ⅲ期臨床研究(NCT02600296，QRK306)，預計將會招募634位患者。與此同時，Quark啟動了一項II期研究用以預防心血管外科手術患者出現的急性腎損傷。
QPI-1007 and mRNA target sequences
QPI-1007
化學合成修飾的雙鏈小幹擾RNA，靶向於caspase2基因用以暫時性抑制caspase2基因的表達。該化學修飾的化合物由Quark公司開發，並受專利保護。獨特的藥物設計，使其具有高度特異性的RNAi活力，同時減弱了脫靶效應及免疫刺激反應。QPI-1007作為一種神經保護劑，用來治療非動脈炎性前部缺血性視神經病變及其他諸如青光眼等視神經疾病導致的視網膜神經節細胞死亡(RGCs)。QPI-1007在非動脈炎性缺血性視神經病變治療中的應用被美國FDA授予孤兒藥地位。
細胞凋亡是視網膜神經節細胞(RGCs)死亡的主要原因，可導致非動脈炎性前部缺血性視神經病變及青光眼在內的視神經病變。Caspase2是促凋亡家族肽酶成員之一，地位獨特，能夠介導受體誘導型及線粒體型細胞凋亡。QPI-1007在動物模型中的研究表明：①Caspase2在視網膜神經節細胞中的激活；②玻璃體腔給藥後視網膜神經節細胞中siRNA的攝取；③吸收後的藥物以RNAi的方式發揮作用；④QPI-1007在四種視網膜神經節細胞損失動物模型中的治療效果。
QPI-1007已在低視力的視神經萎縮患者及急性NAION患者中開展了臨床Ⅰ/Ⅱa期研究(NCT01064505)，給藥方式為單次玻璃體腔內注射。該研究在美國及以色列同時開展，目前已經結束。該藥物同時也開展了一項隨機雙盲對照試驗(NCT01965106)，用以評估對原發性急性閉角型青光眼的療效。值得關注的是，2015年12月蘇州瑞博生物技術有限公司與其戰略合作夥伴美國Quark製藥公司開發的小核酸藥物QPI-1007在中國的國際多中心臨床試驗正式獲得國家食品藥品監督管理局(CFDA)批准開展II/III期關鍵性臨床試驗，令人期待。這也是中國第一個獲批臨床研究小核酸藥物。
Schematic representation of a stable-nucleic-acid-lipidparticle (SNALP)
TKM-080301 (TKM-PLK1)
Arbutus Biopharma研發的一款靶向於PLK1的siRNA類藥物，該激酶的過表達會促進腫瘤細胞失控性增殖。目前也有一些PLK1小分子抑制劑類藥物進入了不同的人體臨床研究階段。TKM-080301以穩定脂質體顆粒形式(上圖所示)用於靜脈注射給藥。
臨床前研究詳細評估了TKM-080301在體內外模型中的藥理學活性、對免疫系統的效應及毒性。該藥物可抑制腫瘤細胞的增殖，並能沉默掉PLK1基因；並在人類腫瘤細胞的異源抑制模型中表現出抗腫瘤活性。該藥物的基因沉默效應也通過免疫組化及分子生物學手段得到了驗證；單次給藥引發的PLK1基因沉默可持續7-10天，且並未引發明顯的免疫反應。針對TKM-080301開展的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究在晚期實體瘤或淋巴瘤，以及神經內分泌腫瘤(NET)或腎上腺皮質癌(ACC)患者中開展。由於PLK1在多種類型的癌症患者中存在表達量異常，因而該類別siRNA藥物市場前景廣闊。然而，PLK1是一類成藥性較好的靶點，目前已有多種小分子抑制劑類藥物處於不同臨床研究階段，如Volasertib等。因而，TKM-080301也面臨諸多藥物的競爭。
ATU027
Silence Therapeutics公司研發，一種化學合成的siRNA用以沉默掉PKN3基因，後者為PI3K信號下遊分子。作為內皮調節性藥物，ATU027可以穩定血管完整性、對抗腫瘤區域的炎症反應，並減少轉移性腫瘤細胞的擴散。該藥物的作用靶點為PKN3 mRNA上的5′-agacuugaggacuuccuggacaa-3′序列。ATU027為雙鏈平末端，長度為23bp的寡核苷酸並經過了化學修飾；其給藥形式為脂質體。
臨床前研究表明，ATU027具有抗腫瘤活性，並能阻止腫瘤的肺部轉移。一期臨床研究(NCT00938574)在晚期難治性實體瘤患者中展開，用以評估ATU027單次或重複給藥時的安全性、耐受性、藥代動力學、藥效學及抗腫瘤活性。ATU027還開展了另一項Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，用以評估在晚期或轉移性胰腺癌患者中，該藥物能否與標準化療藥物吉西他濱聯合給藥。在腫瘤治療領域，胰腺癌一直是科學家們面臨的最大挑戰之一，具有很強的侵襲性和轉移性。而現有的臨床研究表明，ATU027同吉西他濱的聯合用藥可以提高晚期轉移性胰腺癌的無進展生存率，有望為胰腺癌的治療帶來希望。
Pipelines of Sylentis
SYL040012 (Bamosiran)
靶向於β2腎上腺素受體的siRNA，用於青光眼的治療。青光眼是一種引起視力損害的眼科疾病，由於進行性視神經損傷而導致失明。青光眼的主要危險因素是眼壓升高、遺傳和種族背景以及年齡。眼壓升高則是由於水性成分的產生及排除兩者間的失衡所造成。減少水性成分的產生和控制眼壓的藥物對青光眼患者是很有價值的。β-阻斷劑產生這種效應，可以用於治療青光眼。不同於阻斷2腎上腺素受體的功能，另一種策略為通過RNA幹擾方式敲低相應基因的mRNA表達量。SYL040012是一種合成的長度為21bp的siRNA，以裸露的形式存在，靶向於β2腎上腺素受體的mRNA。
在臨床前研究中，SYL040012能特異性降低約50%的β2腎上腺素受體的mRNA，而對其他類型的腎上腺素受體則無顯著效應。藥物能夠迅速進入眼睛併到達不同的結構組織中；並且只有少量非活性形式的藥物會進入血漿和其他器官。眼部的特性十分有利於siRNA分子的給藥，第一個進入臨床研究的RNAi藥物便是眼部疾病治療領域。針對SYL040012分子開展的第一項臨床一期研究(NCT 00990743)在眼壓低於21mmHg的健康志願者中評估了藥物的安全性、耐受性及生物利用度，表現較佳。另有三項臨床研究也已完成，分別是代號為NCT01227291的Ⅰ/Ⅱ期研究用以評估在未服藥眼壓升高患者中的藥物耐受性及療效；代號為NCT01739244的Ⅱ期研究用以評估SYL040012對高眼壓症和開角型青光眼患者的耐受性及療效；代號為NCT02250612的Ⅱ期研究，用以評估四種劑量的SYL040012滴眼液在降低開角型青光眼患者眼壓中的療效，並以0.5%馬來酸噻嗎洛爾作為對照。
SYL1001
是一類基於siRNA設計的用於預防和治療眼痛及乾眼症候群的藥物，給藥形式為滴眼液局部給藥。乾眼病的治療對於眼科而言仍是一個巨大的挑戰，目前常用的措施包括環孢菌素、消炎藥，人工淚液和其他藥物等。SYL1001本身並不能阻止發病過程，但卻可以緩解患者所面臨的眼部疼痛。SYL1001的受體是辣椒素受體TRPV1，一類存在於角膜及相應神經末梢的傷害性感受器。體外模型開展的臨床前研究中，SYL1001表現出良好的安全性及療效。目前針對SYL1001開展了兩項臨床Ⅱ期研究，分別為NCT01776658及NCT02455999用以評估其對眼痛伴乾眼症候群患者的安全性及療效。考慮到疼痛在其他眼科疾病中也是高頻出現的一種臨床症狀，SYL1001的市場極為廣闊。乾眼症是一種治療方法複雜的疾病，SYL1001隻能用於鎮痛和緩解症狀，而不能替代免疫抑制劑類藥物如環孢黴素及其他藥物。因而，需要開展多中心的Ⅲ期臨床研究用以評估在大量患者群體中，該siRNA藥物是否還表現出良好的療效及安全性。
Pipeline of Silenseed
siG12D-LODER
根據美國國家癌症研究所(NCI)的數據，美國2014年的胰腺癌新病例和死亡病例分別為46420和39590。胰腺導管腺癌是最常見的胰腺腫瘤，佔胰腺癌病例的95%。它從細胞、形態和結構變化的遞進級聯演化，這與癌基因和腫瘤抑制基因的體細胞突變有關。最值得注意的是，幾乎所有的胰腺導管腺癌包括KRAS基因突變，特別是一個叫做G12D突變。Silenseed公司所研發出的siG12D-LODER可釋放出特異性的siRNA分子，能夠在長達四個月的時間裡，在胰腺癌患者體內降低或沉默KRAS G12D突變體的表達。體外模型及小鼠體內開展的臨床前研究中，該藥物表現出良好的療效，能夠有效誘導細胞凋亡從而遏制腫瘤的增長。2011至2013年，該藥物開展了一項開放標籤，多中心的I / IIa期臨床研究，所招募患者為未經手術的局部晚期胰腺癌患者。在該研究中，siG12D-LODE表現出高度的安全性。療效測試中，在腫瘤響應率、腫瘤標誌物減少程度、轉移時間、無進展生存率及總體生存率等方面，該藥物均取得了令人鼓舞的初步結果。
The role of miR-122 in HCV infection andantiviral action of Miravirsen
Miravirsen
2014年8月4日，羅氏(Roche)宣布收購丹麥製藥商Santaris，該公司總部位於丹麥哥本哈根，是一家私人持有的生物製藥公司，該公司開創的專有鎖核酸(locked Nucleic Acid，LNA)平臺，使RNA靶向治療跨入了一個嶄新的時代。Miravirsen是最早進入到臨床研究階段的miRNA藥物之一，採用鎖核苷酸(LNA)技術的一段15nt長度反義RNA鏈，可同miR-122的5』端互補治療HCV感染。後者對宿主的侵染過程嚴重依賴肝臟中豐度最高的miR-122。在嚙齒類及非人靈長類動物模型中的臨床前研究表明，Miravirsen展現出良好的肝臟輸送效率、膽固醇積累量降低及HCV滴度減小，並據此於2009年啟動Ⅰ期臨床試驗。Ⅰ期臨床結果同在非人靈長類動物模型中的結論一致，推動了Ⅱa期臨床試驗的開展。該項Ⅱa期研究在7個國際中心展開，研究人員評估了Miravirsen用於36例慢性HCV1型感染患者的安全性和有效性。試驗表明Miravirsen用於慢性HCV1型感染患者表現出長期劑量依賴性地減少HCV RNA水平的效應，且未出現病毒抵抗性。值得關注的是，近期有報導表明，在體內外的測試中，隨著Miravirsen使用劑量的提高，HCV病毒RNA的5』 UTR區域開始出現突變。雖然尚不清楚這些突變是否會導致抗藥性的出現，對兩者間相關性的分析迫在眉睫。
縮略詞表：
ACC：adrenocorti calcarcinoma
ADRB2：adrenoceptor beta 2
AKI：acute kidney injury after cardiac surgery
AMD：Age-Related Macular Degeneration
ApoE：apolipoprotein E
CASP2：Caspase 2
DME：Diabetic Macular Edema
HCC：hepatocellular carcinoma
KRAS：Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
LNA：locked nucleic acid
miR-122：microRNA 122
NAION：non-arteritic ischemic optic neuropathy
PKN3：protein kinase N3
PLK1：Polo-likekinase-1
TRPV1：transient receptor potential vanilloid 1
LNP：Lipid nanoparticle
PEG：Polyethylene glycol
PLGA：poly(lactic-co-glycolic)acid
RISC：RNA-induced silencing complex
RNAi：RNA interference
SNALPs：Stable nucleic acid lipid particles
參考文獻：
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2.Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jun；6(6):443-53.
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6.https://en.wikipedia.org/wiki/Transthyretin-related_hereditary_amyloidosis
7.Philip N.Hawkins，Yukio Ando，Angela Dispenzeri，Alejandra Gonzalez-Duarte，David Adams & Ole B. Suhr (2015): Evolving landscape in the management oftransthyretin amyloidosis，Annals ofMedicine，DOI: 10.3109/07853890.2015.1068949
8.http://quarkpharma.com/
9.http://www.sylentis.com
10.http://silenseed.com/