Plant Physiol：隱花色素在光周期開花調控中的作用機制

前言

2020 年 7 月，上海師範大學楊洪全教授為通訊作者，在 Plant Physiology 雜誌（IF: 6.902）在線發表了題為「Photoexcited Cryptochrome 2 Interacts Directly with TOE1 and TOE2 in Flowering Regulation」的研究論文，深入解析了隱花色素 2 在開花調控中的作用機制。

文章中酵母文庫實驗由歐易生物完成。

研究背景

隱花色素 CRYs 是藍光受體，參與了動植物中多種光信號的響應。擬南芥中有兩個隱花色素 CRY1 和 CRY2，可以介導包括光周期開花啟動等許多光反應。CRY2 通過與蛋白泛素化 E3 連接酶 COP1 及其增強子 SPA1 結合，以穩定調控蛋白 CONSTANS (CO) 和促進 FT 基因的轉錄，並啟動開花。轉錄因子 TOE1 可以通過間接抑制 CO 轉錄活性、直接與 FT 結合，以實現對 FT基因轉錄和開花的負調控。但 CRYs 與 TOEs 如何協同作用以實現對開花過程的調控？

研究內容

本研究證明 CRY1 和 CRY2 在開花調節中以藍光依賴的方式與 TOE1 和 TOE2 發生直接結合。遺傳研究表明，TOE1 和 TOE2 突變部分抑制了 cry1 cry2 突變植株的晚花表型。藍光觸發的 CRY2 與 TOE1 和 TOE2 的相互作用促進了 TOE1 和 TOE2 與 CO 的解離，從而減輕了它們對 CO 轉錄活性的抑制並增強了 FT 轉錄。本研究還表明 CRY2 抑制了 TOE1 與 FT 增強子內調控元件的結合。這些結果揭示了 TOE1 和 TOE2 作為 CRY2 的下遊組分，通過調節 CO 活性和 FT轉錄部分介導了 CRY2 對光周期開花的調節。

研究結果

1. CRY1、CRY2 可以與 TOEs 直接結合

已有研究表明，CRY1 的 N 端結構域（CNT1）能夠單獨介導下胚軸伸長的藍光抑制。以 CNT1 為誘餌，通過酵母雙雜交進行篩選，結果顯示 TOE1 可以與 CNT1 互作。一對一酵母驗證實驗顯示，在黑暗和藍光條件下，TOE1 都可以與完整的 CRY1 發生互作。同時酵母雙雜交實驗表明 TOE2 也可以分別與 CNT1、CRY1 互作（下圖 A、B）。同樣，CNT2、CRY2 也可以與 TOE1、TOE2 發生互作（下圖 C）。

同時，分段進行 pull-down 實驗表明（下圖 D-G），CRY1、CRY2 的 N 端和 C 端都可以分別與 TOE1、TOE2 發生直接結合。同樣，對 TOE1、TOE2 分段克隆進行酵母雙雜一對一驗證，結果表明與 CRY2 的結合依賴於 TOE1、TOE2 的 N 末端結構域。

圖片說明：A) 酵母雙雜交篩選顯示 CNT1 可以與 TOE1、TOE2 結合；B) C) 不同光照條件下，酵母雙雜交驗證 CRY1、CRY2 與 TOE1、TOE2 結合；D) – G) pull-down 檢測 TOE1、TOE2 與 CRY1、CRY2 不同區段的結合能力

2. CRY1、CRY2 可以在植物細胞內與 TOE1、TOE2 結合

在菸草葉片細胞進行螢光定位實驗（圖 A），結果顯示 TOE1、TOE2 與 CRY1 共定位於相同的核體。BiFC 實驗、雙螢光互補實驗（圖 B-G）也顯示類似的結果，表明 CRY1 可以在植物細胞內與 TOE1、TOE2 結合。

同樣採用上述實驗手段證實，CRY2 也可以在植物細胞內與 TOE1、TOE2 結合。

圖片說明：A) CRY1 與 TOE1、TOE2 螢光共定位實驗；B) – G) 雙螢光互補實驗檢測 TOE1、TOE2 與 CRY1 及其不同區段的相互作用

3. CRY1、CRY2 以藍光依賴的模式與 TOE1、TOE2 結合

為了研究不同光照對 CRY 與 TOE 蛋白結合的影響，semi-in vivo pull-down 實驗顯示，在藍光暴露條件下幼苗中 TOE1、TOE2 可以 pull down 下來 CRY1、CRY2，但無法在黑暗、紅光或遠紅光暴露的幼苗中 pull down（下圖 A-D）。

將過表達 TOE 的 mTOE1-Flag、mTOE1-Flag 分別與過表達 CRY 的 Myc-CRY1-OX、Myc-CRY2-OX 的擬南芥雜交，在雙轉基因系（Myc-CRY1-OX/mTOE1-Flag、Myc-CRY2-OX/mTOE1-Flag、Myc-CRY1-OX/mTOE2-Flag、Myc-CRY2-OX/mTOE2-Flag）中進行 Co-IP。結果顯示，在藍光條件下培養的擬南芥中，利用 Myc-CRY1、Myc-CRY2 可以 IP 到 TOE1-Flag、TOE2-Flag（下圖 E-H）。以上結果表明 CRY1、CRY2 以藍光依賴的模式在植物體內與 TOE1、TOE2 結合。

圖片說明：A) – D) semi-in vivo pull-down 檢測不同光照條件下 CRY1、CRY2 與 TOE1、TOE2 的結合；E) – H) Co-IP 檢測不同光照條件下 CRY1、CRY2 與 TOE1、TOE2 的結合

4. 長日照下 TOE1、TOE2 作為 CRY1、CRY2 的下遊參與開花時間調控

長日照條件下，與 cry1 cry2 雙突變體相比，toe1 toe2 cry1 cry2 四突變體開花時間明顯更早，但又顯著晚於 toe1 toe2 雙突變體（下圖 A-C）。相應地，RT-PCR 也顯示 FT 基因表達量在四突變體中高於 cry1 cry2 雙突變體，但低於 toe1 toe2 雙突變體；CO 表達量變化不明顯。在 cry1 cry2 雙突變體中轉入 mTOE1-Flag、mTOE2-Flag，會導致開花時間進一步延遲（下圖 D-J）。以上結果表明，TOE1、TOE2 作為 CRY1、CRY2 的下遊參與對開花時間的調控。

圖片說明：A) -F) 雙突變體和四突變體開花時間統計；G) H) WB 檢測 TOE1、TOE2 蛋白表達水平；I) J) 在野生型和雙突變體中過表達 TOE1、TOE2 對開花表型影響

5. CRY2 促進了 TOE1、TOE2 與 CO 的分離

TOEs 主要作用是與轉錄因子 CO 結合以抑制其轉錄激活活性。Pull-down 實驗顯示（下圖 A、B），TOE1 可以與 CO 結合，而 CRY2 的存在可以減弱 TOE1 與 CO 的結合。同時，與黑暗條件相比，藍光暴露的 CRY2 過表達幼苗中 TOE1 與 CO 的結合減弱（下圖 C）。雙螢光互補實驗、co-IP 實驗也顯示，在 CRY2 存在的條件下，TOE1 與 CO 的結合受到了抑制。semi-in vivo pull-down 實驗顯示（下圖 K、L），與黑暗培養幼苗相比，在藍光暴露條件下幼苗中 TOE1 可以 pull down 下來 CO 更少，但 cry1 cry2 雙突變體中 CO 蛋白的量不受影響。以上結果表明，藍光條件下 CRY2 與 TOE1 的結合導致 TOE1 與 CO 的結合減弱。

同時，雙螢光報告實驗證實，共表達 TOE1/TOE2 和 CO，FT 表達受到明顯抑制；而同時再共表達 CRY2 後，FT 表達的抑制現象明顯減輕。

圖片說明：A) – C) pull down 檢測 CO 與 TOE1 的結合；D) – I) 雙螢光互補實驗檢測 CO 與 TOE1 的結合；J) Co-IP 檢測 CO 與 TOE1 的結合；K) – L) semi-in vivo pull-down 檢測 CO 與 TOE1 的結合。

6. CRY2 抑制了 TOE1 結合到 FT 3』端調控區

已知 TOE1 通過結合到 FT 基因的啟動子區域和 3』端調控區以調控 FT 的轉錄。ChIP PCR 顯示（下圖 A、B），與野生型相比，cry1 cry2 雙突變體中 TOE1 顯著富集結合到 FT 基因的區域 R，暗示 CRY2 可能抑制了 TOE1 和 FT 3』 端的結合。

EMSA 實驗顯示，FT 基因上的 TBS-like motif CCTCGAC 對於 TOE1 的結合是必需的，而在 CRY2 存在下 TOE1 與該 motif 的結合減弱（下圖 D）。

研究結論

本研究揭示了一個光周期開花調控的新模式：在長日照條件下，CRY2 表達激活，CRY2 以藍光依賴的模式與 TOE 結合，抑制了 TOE 與 CO 的結合、以及 TOE 對 FT 轉錄的激活作用，最終實現對植物的光周期開花調控。

參考文獻

Shasha Du, Ling Li, Li Li, et al. Photoexcited Cryptochrome 2 Interacts Directly with TOE1 and TOE2 in Flowering Regulation. Plant Physiol 2020; doi: 10.1104/pp.20.00486.