周培源1902年8月28日出生於宜興芳橋後村一個開明紳士家庭。4歲時在本村私塾讀書,1910年在夏芳小學讀書。辛亥革命爆發後，因鄉下生活不安定,1912年舉家遷往南京，轉學於金陵大學附屬小學和另所師範院校的附屬小學。1913年，全家又遷往上海，他插班進了上海市立萬竹小學(現為上海市實驗小學)。在這裡，他受到了正規而良好的教育，從此引發了他的學習興趣，成績提高很快，於1916年期滿畢業。
從萬竹小學畢業後，不願學商的周培源先後離開父親為他選擇的南洋商業學校和杭州甲種蠶桑學校，進入上海的一所教會學校——聖約翰大學附屬中學就讀,1919年由於參加五四愛國運動而被校方開除周培源回到故鄉，父親對他的「惹是生非」十分惱怒，常加責備。他便躲到芳橋附近的潮音寺閉門讀書。一天他在瀏覽報紙時無意看到條清華學校在江蘇招考5名插班生的廣告，便毅然赴寧報考，以第五名的成績被錄取。1919年暑假過後，他隻身離鄉北上，進了清華校園，邁出了人生道路上決定性的重要一步。
清華學校前身是成立於1909年的遊美學務處,1911年易名清華學堂,1912年改稱清華學校，它是通過美國退還的部分「庚子賠款」辦起來的。當時分中等科、高等科兩部分，每科4年。從中等科到高等科的二年級，相當於現今中學階段的6年。而由高等科畢業後，要經過嚴格選拔，「品學兼優」者才可被直接送往美國留學，插入美國大學二三年級，學成後回國。由於對出國人員選拔十分嚴格學校實行淘汰制，因而每年都要招收插班生。周培源初進清華時被插入到中等科三年級學習。這裡優良的環境、一流的師資使其如魚得水，便如饑似渴地在知識的海洋中盡情遨遊。由於他各科成績優異，一個月後升入中等科四年級。中等科畢業時，成績名列班級第二，順利升入高等科。在讀高等科三年級時，他把解析幾何的方法引入號稱「世界三大難題」的「三等分角」的研究，被數學老師鄭之蕃評價為創新之舉。一年後，他的科學論文《三等分角二則》在《清華學報》第一卷第二期上發表，初步顯露出他在科學研究方面的才華。1924年秋，他以優異成績畢業，取得留學美國的資格。
周培源原本立志學工，以便將來回國直接為發展祖國工業、加強國防服務，但因愛因斯坦的「相對論」引起整個世界轟動，激發了他對物理的興趣。又因芝加哥大學有著名的光學家麥格森教授和1923年諾貝爾物理獎獲得者密立根教授等一批著名教授執教而蜚聲世界，於是進入芝加哥大學數理系學習。在芝加哥大學他惜時如金，僅用2年時間，累計通過47門課程，取得學士、碩士學位。1927年春，周培源進入加州理工學院攻讀博士學位。1928年初周培源尚未畢業，就被導師貝爾推薦參加該年美國數學學會會議，並在會上作「勞倫茲變換的一個新推演」的學術報告。他是與會者中唯一做學術報告的學生。不久周培源又以《在愛因斯坦引力論中具有旋轉對稱性物體的引力場》的博士論文順利通過答辯，成為1928年全美數學和物理學領域畢業的49名博士之一，也是留美取得理論物理博士學位的第二位中國人。這樣，從1924年秋至928年春，周培源僅僅用了3年半的時間就連克學士、碩士、博士3個學位，完成一般人6到8年才能完成的學習任務，創造了清華留學生乃至中國留學生史上的奇蹟，而這個奇蹟的創造是靠他一生的座右銘勤奮」兩字實現的。
1928年夏，獲得博士學位的周培源繼續滯留半年左右，先後在哈佛大學、普林斯頓大學和康奈爾大學作短期訪問學習。1928年秋赴歐洲先後在德國的萊比錫大學和瑞士的蘇黎世高等工業學校跟從海森堡和泡利教授進行量子力學的研究。不久，應國立清華大學校長羅家倫的邀請，欣然應允回國任教。
1929年，年僅27歲的周培源回到清華園，成為物理系一名才學卓著的年輕的物理學教授，開始了他一生中教書育人、科學研究的最光輝的歷程。