研究發現PANDAS複合物在piRNA調控異染色質形成的分子機制

 

轉座子（transposon）由冷泉港實驗室Barbara McClintock（諾貝爾獎）首先在玉米中發現。轉座子又被稱為「跳躍基因」，類似於內源性病毒，能夠在宿主基因組中「複製和粘貼」自己的DNA，以達到其自我「繁殖」的目的。轉座子的「跳躍」可能會產生基因組不穩定性，並導致動物不孕不育。有多種調控機制沉默轉座元件並維持基因組完整性，例如組蛋白修飾和DNA的甲基化等。為了抵抗轉座子，動物的生殖系統進化出了一類小非編碼RNA——piRNA（Piwi-Interacting RNA）——來嚴格調控轉座子的表達。概念上，真核生物的piRNA通路在功能上類似於原核生物的CRISPR系統。

piRNA簇（piRNA cluster）表達的piRNA長度大約在24到31nt之間，通過與PIWI家族蛋白（Argonaute家族蛋白的一個亞家族）形成piRISC複合物（piRNA induced silencing complex）而起作用。piRISC複合物能在轉錄（TGS，Transcriptional gene silencing）和轉錄後水平的沉默轉座子（PTGS，Post-transcriptional gene silencing）上起作用。PTGS主要通過「桌球循環」（ping-pong cycle）在切割piRNA靶標的同時產生更多的新生piRNA，從而形成類似「先天免疫系統」的正反饋，在細胞質層面降解轉座子RNA。TGS是在轉錄水平沉默目標轉座子——最終結果是誘導轉座子插入位點形成組成型異染色質。轉座子的沉默通常跟組蛋白修飾（H3K9me3）有很強的相關性。目前認為，Piwi/piRNA複合物通過轉座子新生RNA招募Panoramix（Panx），並最終導致轉座子區域異染色質的形成，該過程需要H3K9me3甲基化轉移酶SetDB1/Eggless和H3K4me3去甲基化酶LSD1。

9月30日，中國科學院生物物理研究所俞洋團隊和中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所黃旲團隊（現上海交大醫學院）在Nature Cell Biology 雜誌上以長文形式在線發表了題為A Pandas complex adapted for piRNA-guided transcriptional silencing and heterochromatin formation 的研究，該工作在俞洋/Hannon之前的工作基礎上進一步深入闡明了piRNA介導的轉座子異染色質形成的分子機制。該研究發現，生殖細胞特異表達的核轉運因子（NXF）家族蛋白dNxf2能與dNxt1（P15）以及Panx形成三元複合物，並通過競爭性結合阻止dNxf1（又叫TAP，是介導mRNA出核的經典接頭蛋白）與核孔互作，從而導致了轉座子新生RNA在核內的滯留。該文章首次證明PANDAS（Panoramix-dNxf2 dependent TAP/p15 Silencing）複合物的存在，並提出了RNA介導異染色質形成的新理論，既阻斷新生RNA出核在調控異染色質過程中起核心作用，又為將來研究其它RNA介導的表觀遺傳調控提供指導意義（圖1）。該文章的發表，也給今年四月份在BioRxiv同時上線的關於Drosophila Nxf2的四篇預印本文章之間的良性競爭畫上句號。

該研究中，俞洋課題組充分利用果蠅這一模式生物的優勢，綜合分析針對piRNA通路的全基因組RNAi篩選結果和flybase中全蛋白組免疫沉澱質譜的大數據，再結合已建立的RNA拴住報告基因篩選體系，首先快速鎖定了dNxf2在piRNA/Panx介導的轉座子沉默過程中的核心作用。與此同時，俞洋課題組通過和專注於piRNA通路的結構生物學家黃旲課題組的精誠合作，解析了Panx-dNxf2互作結構域的晶體結構。作者通過晶體結構的分析發現，dNxf2的UBA結構域一方面進化出跟Panx直接互作的疏水界面，另一方面也丟失了一般NXF家族蛋白固有的結合核孔複合物的能力（從而解釋了為什麼dNxf2不能像dNxf1一樣介導mRNA出核），為在分子層面進一步理解dNxf2的作用機制奠定了堅實基礎（圖2）。

由於dNxf2能跟Panx能形成相互依賴的複合物，dNxf2有著跟Panx類似的誘導基因沉默的功能，即可以通過新生RNA介導基因沉默和異染色質形成。和其它經典piRNA通路蛋白一樣，dNxf2的缺失會導致動物體完全不孕不育。有趣的是，小鼠的Nxf2敲除之後在特定條件下也有不育的表型。一系列分子生物學實驗和遺傳學（co-IP/IP mass spec，GST pull-down，Y2H，GoldCLIP等）也證實dNxf2確實是Panx介導轉座子沉默過程中的核心蛋白。但是，作者在研究過程中發現，在dNxf2缺失並一同過表達Panx的條件下，轉座子的H3K9me3基本保持不變。具有諷刺意味的是，在此條件下果蠅卻是完全不育的，因為轉座子仍然是大規模上調的。該結果也直接暗示兩點：1. H3K9me3隻是異染色質形成的必要非充分條件。2. dNxf2調控轉座子沉默的分子機制不僅僅是招募Panx以及下遊的甲基化轉移酶SetDB1那麼簡單。

通過大量的文獻閱讀以及跟研究RNA出核方面的專家（程紅）討論，作者意識到如果僅是dNxf2自身失去核孔複合物結合能力並不足以解釋為什麼轉座子RNA不能出核。dNxf2還需要阻止經典的mRNA出核通路，即通常依賴於mRNA 的5』Cap結構招募的dNxf1（TAP）複合物。而前人研究也暗示NXF家族蛋白有能力形成異元二聚體，因此，作者大膽假設dNxf2可能通過抑制dNxf1複合物來阻止轉座子mRNA的出核。令人興奮的是，各方面數據包括co-IP，GST pull down，Split luciferase和交聯質譜等都充分支持dNxf2：dNxf1能直接互作（圖3）。

最後，作者通過體外競爭實驗和體內瞬時RNA拴住實驗為dNxf2抑制dNxf1介導的RNA出核功能這一假說提供了充分的證據（圖4）。非常有意思的是，程紅課題組最近在哺乳動物的細胞的研究表明Nxf1是RNA聚合酶Pol II有效延伸（transcription elongation）所必須的。因此，dNxf2抑制Nxf1的後果很可能不僅僅是阻止轉座子RNA的出核，很有可能PANDAS會導致Pol II轉錄延伸的停止。雖然這個理論亟待證實，但是它可以被完美地統一在現有的piRNA介導轉座子轉錄沉默的模型中。(生物谷Bioon.com）