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孫佳楠
治療性寡核苷酸大多由化學合成法生產,其雜質主要有截短序列(「shortmers」)型、延長序列(「longmers」)型和全長修飾的產物。其中n-x(指5』端不完全鹼基偶聯產生的缺失序列)型雜質最為常見,主要由於5』端鹼基偶聯失敗,加帽不完全導致,同時也會產生不同單個鹼基缺失的n-1型雜質。延長型雜質主要是n+1或n+2類,修飾型雜質的位點主要發生在核苷酸鹼基或硫代磷酸酯鍵。
儘管化學修飾的寡核苷酸通常非常穩定,但不同的序列和應激源影響其降解速度,從而引入一些降解雜質。IP-RPLC-MS先進的分析方法成為表徵各種含量非常低的寡核苷酸雜質和降解產物必不可少的工具,我們上期微信稿質譜方法優化|寡核苷酸藥物序列、修飾和異構體的鑑定展示基於HRAM的ddMS2方法能夠實現可靠的鑑定和翻譯後修飾位點的定位。
本次分享賽默飛高級產品經理劉海川博士將ddMS2方法擴展到寡核苷酸雜質和降解產物的表徵,及對不同純化方法下雜質的相對定量。
不同純化方法的DNA 21mer (CAG TCG ATT GTA CTG TAC TTA) 購於Integrated DNA Technologies公司(Coralville,IA, U.S.A.)。
樣品A:標準脫鹽純化後產品;
樣品B:HPLC純化後產品,LC-MS進樣濃度為100µg/mL。
★強制降解樣品製備:將標準品(1mg/mL)置於80°C分別持續1,2,4和24h後,冷卻至室溫,稀釋到100µg/mL,進行LC-MS分析。
★強制氧化樣品製備:將標準品(1mg/mL)與5%H2O2在室溫下分別孵育1,2,4,6和24h,稀釋到100µg/mL,進行LC-MS分析。
Thermo Scientific™ DNAPac™ RP column (4 μm, 2.1 × 50 mm, P/N088924) 色譜柱;
★Mobile Phase A:2%(~190 mM) HFIP and 0.1% (~5.7 mM) DIPEA in water (pH 7.8);
★Mobile Phase B:0.075%(~7.1 mM) HFIP and 0.0375% (~2.1 mM) DIPEA in methanol;
圖1. 液相梯度(點擊查看大圖)
質譜儀:Orbitrap Exploris 240
質譜方法參數設置如圖2所示。
圖2A.離子源參數
圖2B.質譜一級全掃描參數
圖2C.質譜數據依賴型掃描方法參數
數據分析軟體:BioPharma Finder4.0
使用120K解析度將21mer樣品的單同位素峰實現基線分離(圖3),且測得精確質量偏差<1ppm。(提示:為降低加鹽峰,謹慎選擇流動相及離子對試劑)
圖3.120K解析度下對21mer樣品實現單同位素峰的分辨,且對含量低於2%的加鹽峰實現精確測定(點擊查看大圖)
最佳的NCE取決於寡核苷酸序列、長度、修飾和電荷狀態,需詳細優化,見微信稿質譜方法優化|寡核苷酸藥物序列、修飾和異構體的鑑定。圖4顯示使用兩個不同steppedNCE對21mer的9-分子碎裂的碎片覆蓋度和被注釋後的MS2譜圖,stepped NCE(14-16-18)較(10-12-14)獲得更多的碎片離子,達到100%的碎片覆蓋度。
圖4.在stepped NCE(10-12-14)(a-b)和stepped NCE(14-16-18)(c-d)碰撞能量下對21mer的9-分子碎裂,碎片覆蓋圖和被注釋的MS2譜圖(點擊查看大圖)
對兩樣品(A:標準脫鹽純化,B:HPLC純化)的雜質進行鑑定、定位及相對定量
ddMS2方法不僅可以快速確認寡核苷酸序列和修飾位點,而且能夠對色譜圖中無法分辨的含量非常低的雜質進行準確定性。圖5a和5b分別顯示21mer樣品(脫鹽法和HPLC純化)的總離子流色譜圖,陰影部分表示每個樣品中鑑定出的雜質。圖5a插圖表示n-16的選擇離子流色譜圖(SIC)的放大圖,其含量低於0.015%,但該雜質仍可通過高可信度的MS2質譜圖(圖5c)和碎片離子覆蓋度圖(5d)來確證。
圖5.標準脫鹽法(a)和HPLC法(b)純化21mer後的總離子流色譜圖,其中陰影表示寡核苷酸及鑑定出的雜質。對於豐度極低的n-16(~0.015%)雜質仍有高可信度的MS2譜圖(c)及碎片離子覆蓋度圖(d)進行準確確證(點擊查看大圖)
此外,比較脫鹽和HPLC方法純化的兩個樣品的質譜峰面積及其n-x雜質豐度的百分比。在兩個樣品中,主成分的總面積幾乎不變(圖6a),但n-x雜質的豐度比卻顯著降低(從2.55%降至1.18%)。與脫鹽樣品相比經HPLC純化的樣品短鏈雜質含量更低(圖6b,6c),對於5』末端帶有磷酸鹽的n-x雜質也有相似的趨勢。
圖6.BioPharma Finder4.0軟體針對兩種不同純化方法樣品及其雜質進行精準的定性和相對定量(點擊查看大圖)
在體內或生理條件下DNA的降解高速發生,為詳細了解合成類寡核苷酸的降解途徑,酸、鹼、強制氧化、熱和光解等應力得到廣泛的研究,本次研究熱和氧化對21mer樣品的影響。圖7展示對樣品加熱時長在2-4h之間時,21mer主成分含量顯著降低;6h後檢測到各種長度的降解產物,24h後主成分和大片段雜質幾乎完全降解。
圖7a.在80°C加熱條件下,不同加熱時間的總離子流色譜圖(TIC);7b. 主成分的選擇離子流色譜圖(SIC);7c.不同時間點主成分峰面積的匯總圖(點擊查看大圖)
在熱應力條件下不同類型雜質的行為不同(圖8),雜質n-1的相對含量隨著加熱時間的延長逐漸降低,雜質n-5在1h時增加,然後穩定降低,在加熱24h後小片段雜質含量顯著增加如n-18。但是該樣品在熱應力下,帶有5』-PO4H的n-x型降解產物(圖8b),鹼基丟失產物(圖8c),及去嘧啶或去嘌呤有關的雜質顯著增加(圖8d)。
圖8a.n-x(5』-OH)型,圖8b.n-x(5』-PO4H)型,圖8c.鹼基丟失型,圖8d.去嘌呤和去嘧啶型雜質在不同時間點下的相對含量變化(點擊查看大圖)
與熱應激相反,氧化應激並未導致21mer樣品的TIC發生顯著變化(圖9a),H2O2處理後n-x雜質含量略有增加,但隨著時間的延長保持穩定(圖9b),然而氧化的21mer成分升高顯著。總而言之,強制降解實驗展示了ddMS2在單針實驗中能夠鑑定和相對定量雜質的強大功能,以便於深入了解寡核苷酸降解途徑。
圖9a.對照樣品與5%H2O2處理後不同時間點的總離子流色譜圖;9b.n-x型雜質的含量變化;9c.主成分未發生明顯變化;9d.主成分的氧化含量隨著時間的延長顯著提高(點擊查看大圖)
在脫鹽純化的樣品中,檢測到一系列高分子量雜質,主要在~9min被洗脫下來(圖10a),有趣的是這些雜質未出現在HPLC純化樣品中(圖10b),表明HPLC純化法的有效性。在~9min處的色譜峰對應兩個主要成分,圖10c顯示其中一個,Orbitrap Exploris240的超高解析度能夠將這些高分子量雜質進行精確的測定。經過BioPharma Finder軟體的去卷積,雜質分子量與主成分相差n-x,即雜質分子量為M+(n-x)(圖10d),測得質量偏差均小於1ppm(表1)。
圖10a-b.脫鹽、HPLC方法純化後樣品的TIC放大圖;圖10c-d.高分子量雜質的原始質譜圖及去卷積後的質量分布(點擊查看大圖)
表1.高分子量雜質的質量偏差,M=21mer
對高分子量的雜質進行序列鑑定,圖11展示M+(n-1)類型雜質的碎片離子覆蓋度,該雜質通過檢索41nt序列,序列分別產生於21mer的3』端加上n-1的3』端(圖11a)或5』端(圖11b)。21mer3』端加上n-1的3』端序列中未匹配到相應的碎片(圖11a),而5』端則有一系列片段與之匹配(圖11b),確證該雜質的序列。
圖11.M+3』(n-1) 和M+5』(n-1)碎片離子覆蓋圖(點擊查看大圖)
三個案例研究證明了基於Orbitrap平臺能夠快速評估寡核苷酸樣品的純度,並準確鑑定各種雜質,實現對不同純化方法及寡核苷酸雜質、降解產物的深入研究。
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