最新研究駁斥新冠病毒為「人造」產物 蛇不是中間宿主

當科學家們爭相了解更多關於SARS-CoV-2冠狀病毒的信息時，最近對該病毒基因組的兩項研究得出了有爭議的結論：蛇是這種新病毒的中間宿主，以及一種關鍵的冠狀病毒蛋白與HIV-1蛋白有著「不可思議的相似之處」。

現在，最新發表在ACS《蛋白質組研究雜誌》上的一項研究反駁了這兩種觀點，並指出，有鱗的、類食蟻獸的穿山甲是在蝙蝠和人類之間傳播SARS-CoV-2的缺失環節。

了解致使新冠肺炎在全球蔓延的SARS-CoV-2病毒的來源和傳播方式，對其控制和治療非常重要。大多數專家認為，蝙蝠是天然的SARS-CoV-2宿主，但要讓這種病毒從蝙蝠傳染給人類，還需要一個中間宿主。

此前，一項研究分析了SARS-CoV-2病毒的基因組，結果表明蛇是這種病毒的宿主，儘管目前已知的冠狀病毒只會感染哺乳動物和鳥類。與此同時，一項不相關的研究比較了新型冠狀病毒和HIV-1的突刺蛋白序列，發現了意想不到的相似之處。雖然作者在受到科學批評後撤回了這篇預印稿，但由此引發了一些謠言和陰謀論，認為這種新型冠狀病毒可能是在實驗室中設計出來的。

現在，Yang Zhang和同事們希望對SARS-CoV-2 DNA和蛋白質序列進行更仔細和完整的分析，以解決這些問題。 

與以前的研究相比，研究人員使用更大的數據集和更新、更準確的生物信息學方法和資料庫來分析SARS-CoV-2基因組。他們發現，與聲稱SARS-CoV-2和HIV-1之間只共享4個突刺蛋白區域不同，這4個序列片段可以在其他病毒中發現，包括蝙蝠冠狀病毒。

在發現蛇是中間宿主的分析有誤後，研究小組從穿山甲組織中分離出DNA和蛋白質序列，尋找類似於SARS-CoV-2的基因。

而研究人員在患病動物的肺中發現了91%與人類病毒蛋白質相同的蛋白質序列。此外，穿山甲冠狀病毒突刺蛋白的受體結合域僅與SARS-CoV-2存在5個胺基酸差異，而人與蝙蝠病毒蛋白的差異為19個。

因此，研究人員認為，這一證據表明穿山甲是最有可能的新冠狀病毒中間宿主，但也有可能是其他中間宿主。 

這篇論文於3月22日發表在《蛋白質組研究雜誌》上，題目為「2019-nCoV基因組的蛋白質結構和序列再分析，駁斥了蛇作為中間宿主以及其與HIV-1的突刺蛋白插入的獨特相似性」。研究團隊來自密西根大學生物化學系、計算醫學與生物資訊學系，Yang Zhang為通訊作者。

研究人員表示，雖然現在人們普遍認為，像菊頭蝙蝠可能是2019-nCoV的天然宿主，但是究竟是哪種動物作為中間宿主將蝙蝠冠狀病毒帶到人類宿主中，目前還不清楚。儘管多項研究表明馬來亞穿山甲是另一宿主，但也一些研究提出穿山甲可能是一種天然宿主，而不是中間宿主。

為了進一步研究2019-nCoV傳播的動物宿主，研究人員使用馬來亞穿山甲的宏基因組樣本，組裝了一種高度相關的冠狀病毒的基因組草圖。組裝的基因組序列的比對結果，特別是在突刺蛋白上的比對結果，表明穿山甲在2019-nCoV的進化及其從蝙蝠向人類傳播中的重要性。

研究結果：

1. 2019-nCoV突刺蛋白不包括HIV-1特有的插入片段

在此前的一篇題為「2019-nCoV突刺蛋白中獨特插入片段與HIV-1 gp120和Gag的異常相似性」的論文中，印度理工學院的Pradhan等人提出了一個發現，即2019-nCoV突刺蛋白特有的四個新插入(圖1)。他們進一步得出結論，這四個插入片段是2019-nCoV受體結合位點的一部分，並且這些插入與HIV-1蛋白具有「不可思議的相似性」，但與其他冠狀病毒則沒有「相似性」。

這些說法在社會上引起了相當大的公眾恐慌和爭議，甚至在論文被撤回後陰謀論也依舊滿天飛。為了研究Pradhan等人的結論是否具有科學的精確性，研究人員重新分析了其中所討論的四個突刺蛋白插入的結構位置和序列同源性。

在研究這四個插入片段的病毒同源性時，研究人員通過非冗餘序列資料庫(NR)對其進行BLAST序列搜索，將搜索結果限制為病毒(taxid: 10239)，但將其他搜索參數保留為默認值。表1列出了為每個插入片段的前5個序列同系物(包括查詢本身)。

之前的說法認為這四個插入片段是2019-nCoV和HIV-1所獨有的，然而所有四個插入片段都可以在其他病毒中找到。事實上，HIV-1蛋白在四個插入片段中只有一個是最常見的，而四個插入片段中有三個是在蝙蝠冠狀病毒RaTG13中發現的。

此外，部分由於這些插入片段的長度很短， 6到8個胺基酸， BLAST的E值（BLAST所使用的參數評估統計學意義的排列，通常需要< 0.01被認為是重要的）幾乎都是> 4，除了蝙蝠冠狀病毒IS2。這些高E值表明，這些相似性中的大多數可能是巧合。

考慮到四個插入片段中有三個是在蝙蝠冠狀病毒RaTG13中發現的，很容易假設這些「插入」可能是直接遺傳自蝙蝠冠狀病毒。目前，至少有7個已知人類冠狀病毒(2019-nCoV、 SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、 HCoV-OC43、 HCoV-NL63和HCoV-HKU1)，其中許多病毒,包括SARS-CoV和MERS-CoV被認為是從蝙蝠傳播的。

為進一步檢查2019-nCoV和蝙蝠冠狀病毒之間的進化關係，與其他人類冠狀病毒相比，研究人員利用MUSCLE創建了一個多重序列比對(MSA)，呈現在圖3中，對於所有七種人類冠狀病毒和兩種蝙蝠冠狀病毒，RaTG13和RsSHC014，它們分別被認為是2019-nCoV和SARS-CoV的祖先。

在2019-nCoV的四個「插入片段」（IS）中，IS1僅具有一個不同於蝙蝠冠狀病毒的殘基，並且七個殘基中的三個與MERS-CoV相同。 IS2和IS3都與蝙蝠冠狀病毒相同。

對於IS4，雖然BLAST的局部序列比對沒有擊中表1中的蝙蝠冠狀病毒，但它與MSA中的蝙蝠冠狀病毒有密切的進化關係。特別是，2019-nCoV的IS4片段「QTQTNSPRRA」中的前6個殘基與RaTG13相同，而蝙蝠冠狀病毒或SARS-CoV中缺失的後4個殘基與MERS-CoV和HCoV-HKU1至少有50%的同源性。

由此，研究人員認為2019-nCoV與蝙蝠冠狀病毒RaTG13之間存在密切的進化關係，Pradhan等人在突刺蛋白中強調的四個插入位點並不是2019-nCoV和HIV-1所獨有的。事實上，在這些非常短的片段上建立的序列比對的相似性在統計學上是不顯著的，這是通過BLAST E值來評估的，而這種相似性在許多其他病毒中也存在，包括蝙蝠冠狀病毒。從結構上看，這些「插入」遠離了與ACE2受體結合的突刺蛋白的結合界面，如圖2所示，這也與Pradhan等人的結論相矛盾。

2. 相對同義密碼子使用度不能識別冠狀病毒的中間宿主

另一項由Wei Ji等人進行的早期研究試圖理解2019-nCoV的感染。在這項研究中，作者分析了2019-nCoV和八個脊椎動物的RSCU（相對同義密碼子使用度，包括兩種蛇(銀環蛇和眼鏡蛇)、西歐刺蝟、中華菊頭蝠、土撥鼠(旱獺)、馬來西亞穿山甲、雞 (普通家雞),和人類(智人)。在這些脊椎動物中，與2019-nCoV相比，蛇的密碼子使用差異最小，因此Ji等人提出，蛇是2019-nCoV的中間宿主。

然而，由於缺乏先前的人畜共患冠狀病毒可以感染哺乳動物和鳥類以外的動物的生物學證據，這一結論在病毒學家中引起了爭議。

此外，最近的研究顯示，初步證據表明，穿山可能是類似2019-nCoV的冠狀病毒的宿主，進一步證明Ji等人的結論無效。雖然關於蛇是中間宿主的結論一直受到科學界的普遍質疑，但是仔細檢查RSCU方法的基礎和可靠性仍然很重要，這將有助於防止這種有偏見的分析誤導科學界和公眾。在最新研究中，我們通過對RSCU分析的大規模複製，仔細研究了生物信息學方法和潛在的生物學假設。

如圖4A所示，蛇並不是RSCU距離2019-nCoV最小的脊椎動物，這說明Ji等人對RSCU分析的實施是不完整的。更重要的是，圖4中的數據顯示，與冠狀病毒傳播無關的動物，如青蛙和蛇，與所有三種冠狀病毒已知宿主的RSCU距離始終較小。

例如，RSCU距離三種不同冠狀病毒最小的脊椎動物是兩種青蛙(Megophrys feae和Liophryne schlaginhaufeni)，而另一種青蛙(Xenopus laevis)在所有序列充足的脊椎動物中RSCU距離最小。

如補充表S1所示，RSCU在中間宿主鑑定失敗的部分原因是，已知使用不同中間宿主（Paguma larvata和Camelus dromedarius）的不同冠狀病毒（SARS-CoV和MERS-CoV），在RSCU中幾乎沒有差異（RSCU距離的平方= 0.12）。 

這些數據表明，RSCU分析本身不夠具體，無法區分來自不同脊椎動物宿主的冠狀病毒。在這方面，失敗不僅是由於使用過時的資料庫或原始分析中包含的少數物種，而且實際上是由於錯誤的生物學假設，即冠狀病毒將進化其RSCU，使其與宿主相似。

3.穿山甲可能是2019-nCoV的中間宿主

在最近的一項研究中，華南農業大學Xiao等人首次在穿山甲中發現了與2019-nCoV高度相似的冠狀病毒序列。此外，三個獨立的研究小組還報告了從馬來穿山甲的宏基因組學樣本中鑑定出2019-nCoV樣冠狀病毒序列，使穿山甲可能成為2019-nCoV的中間宿主。

為了進一步研究這種可能性，研究人員嘗試使用馬來西亞穿山甲的宏基因組樣本重新組裝冠狀病毒的基因組草圖。該基因組草圖顯示，2019-nCoV的總覆蓋率為73%，序列一致性為91%。特別是組裝後的基因組中對病毒識別宿主受體至關重要的突刺蛋白，其變異速度非常快，與2019-nCoV具有高序列同源性，僅存在5個殘基位置差異，而2019-nCoV與蝙蝠冠狀病毒RaTG13的殘基位置差異為19個。這些數據為RaTG13、Manis冠狀病毒和2019-nCoV之間可能的進化關係提供了證據。 

雖然目前的證據主要指向穿山甲是最有可能的中間宿主，但其他動物也有可能成為中間宿主，原因有以下兩個。首先，冠狀病毒已知有多個中間宿主。例如,果子狸是最著名的中間宿主,也使用野生貉和鼬獾作為中間宿主。其次，穿山甲屬冠狀病毒與2019-nCoV之間的91％序列同一性足夠高，可以證實兩種病毒之間的進化關係，但不足以將它們視為相同的病毒物種。從這個角度來看，SARS-CoV和MERS-CoV中間宿主的病毒序列分別與其人類版本的99.8和99.9%相同。因此，即使發現了穿山甲屬冠狀病毒，也應該繼續尋找其它潛在的中間宿主。

原文來源：https://medicalxpress.com/news/2020-03-link-coronavirus-humans-pangolins-snakes.html

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.0c00129#

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