【科研摘要】
酶是自然界的催化劑，在利用可再生資源進行可持續生產方面具有巨大潛力。使酶適應工業過程的要求是在合成精細化學品，食品和藥品的大規模轉化中利用其益處的先決條件。使用天然和合成載體固定野生型或工程化酶已廣泛用於改善催化性能，確保回收和再利用，從而促進其在工業過程中的使用。在過去的三十年中，固定化酶的設計和應用取得了重大進展。作為凝膠固定蛋白的容器，微凝膠正逐漸成為一種有前途的替代品，這反映在越來越多的文獻中，這些文獻證明了它們在可持續催化過程中的使用。微凝膠是交聯的亞微米級膠體聚合物網絡，最近德國亞琛工業大學Ulrich SchwanebergIslam， El-Awaad和Andrij Pich教授團隊在《Green Chemistry》上發表題為Biocatalytic microgels (μ-Gelzymes): synthesis, concepts, and emerging applications的綜述，他們總結了微凝膠酶（μ-Gelzymes）的合成和應用進展。首先探索在微凝膠上或之內用於酶固定的不同方法，並給出在不同應用中使用μ-半酶的代表性實例。隨後，從綠色化學的角度討論了μ-半酶在實現可持續催化方面的潛力。最後，為進一步改進生物催化μ-半胱氨酸酶（作為交互式軟物質的跨學科研究領域）繪製了未來的方向。
【圖文解析】
酶的固定化可以通過物理吸附，捕獲或共價結合來實現。選擇合適的固定化策略和載體材料對於固定化酶的適當性能至關重要。在設計固定策略時，應考慮在活動性和穩定性之間進行權衡。例如，物理吸附通常保持所需的柔韌性以保持酶活性。然而，通常通過瀝濾發生酶負載的逐漸損失。
納米和亞微米尺寸的聚合物材料作為各種貨物的合適載體已引起關注。在這類材料中，微凝膠作為「智能」載體已經引起了人們的特別興趣，這些載體可以設計為對外部刺激作出反應。微凝膠是多孔的，高分子量的膠體聚合物網絡，其尺寸範圍從納米到微米（在本綜述中，作者將尺寸與微凝膠無關）。它們通過結合硬質顆粒，大分子和表面活性劑的性質來結合膠體領域的多樣性。微凝膠具有各種有利的特性，包括可調節的結構，高孔隙率以及可調節的溶脹度和尺寸。它們的大表面積，出色的膠體穩定性，易於合成和後修飾催生了廣泛的應用。例如，微凝膠已用於防汙塗料，藥物和基因傳遞，生物傳感，組織工程，水淨化和植物葉面施肥。關於微凝膠合成，物理特性和應用的各個方面已在數篇優秀的評論中進行了討論。微凝膠由於其化學和機械穩定性，生物相容性，孔隙率以及實現高酶負載的能力而成為理想的酶載體。而且，通過連續聚合過程，微凝膠合成可大規模擴展。此外，通過改變它們的組成，可以獲得響應於外部刺激例如溫度，pH，離子強度和溶劑性質而改變其幾何形狀和親水性/親脂性的刺激響應性微凝膠。在溶脹狀態下，它們柔軟而模糊的表面導致溶劑和溶質分子的高遷移率，從而減少了擴散限制。在塌陷狀態下，微凝膠通常表現為膠體顆粒，這有助於它們從反應混合物中受控地除去。此外，處於溶脹狀態的微凝膠的高水分含量（> 99％）為酶提供了一種水性的，因此是天然的微環境，可以保護它們免受有機介質的侵害。
因此，微凝膠是酶固定的通用平臺。在這篇綜述中，組織探索了微凝膠中不同的酶固定方法以產生μ-凝膠酶，並根據酶負載的方法對其進行了分類（圖1）。後者包括（1）酶與預合成的微凝膠的共價結合，（2）伴隨的微凝膠合成和酶固定，以及（3）利用微凝膠的刺激響應性來固定和控制酶的反應性。組織將在專門的部分中討論每種方法，並重點介紹一些示例，其中μ-Gelzymes已在應用中找到了自己的方法，它們是未來開發的墊腳石。就μ-Gelzyme催化反應的範圍，優勢和局限性進行了批判性的討論，並分析了它們在大規模過程中實現綠色化學的潛力。最後，提出了一種整合方法，通過計算模型將蛋白質工程和微凝膠設計相結合，以進一步發展該領域。
圖1在本綜述範圍內討論的μ-半乳糖酶概述，根據用於酶上樣的方法分為三部分。
2.將酶共價固定在預先合成的微凝膠上
通過在酶表面和微凝膠網絡中的反應性基團之間形成共價鍵，可以將酶固定在預合成的微凝膠中。
2.1使用未修飾的酶進行共價固定
通過在微凝膠中包含羧酸和伯胺官能團，無需進一步修飾酶即可將酶直接共價固定在微凝膠中。引入微凝膠後，可以通過與碳二亞胺反應獲得活化的胺反應性酯（圖2a）或戊二醛進行修飾，以使其隨後與酶的胺官能團偶聯（圖2b）。
圖2.在微凝膠中固定共價酶的策略。
2.2 酶修飾後的共價固定
作者概述了用於共價固定而不修飾或激活酶的策略。但是，也可以在固定化之前修飾酶的反應基團，從而可以在溫和的反應條件下輕鬆地修飾賴氨酸殘基的伯胺官能團以及天冬氨酸和穀氨酸的羧酸官能團（圖2）。這種策略允許對附著點的數量和位置進行更多控制，以實現針對特定地點的固定。
最近，Zou等人將分選酶介導的微凝膠功能化進一步邁進了一步，並固定了五種不同的帶有GGG標籤的酶（枯草芽孢桿菌脂肪酶A（BSLA），鼠疫耶爾森菌植酸酶（Ym-植酸酶），大腸桿菌銅外排氧化酶（CueO漆酶），纖維素酶（CelA2_M2）和巨大芽孢桿菌單加氧酶P450 BM3）。酶用N末端GGG標籤修飾。CueO漆酶和P450 BM3 M2單加氧酶也配有C端LPXTG分選基序（圖3）。
圖3使用分選法將酶固定在微凝膠（μ-Gelzymes）上的位點特異性固定。
3.微凝膠合成過程中的酶固定化
將酶固定在微凝膠中的廣泛研究的方法是在微凝膠合成過程中的包封或束縛（即原位固定）。 根據酶被包埋的步驟，已開發出兩種不同的策略。
3.1 聚合過程中通過封裝固定化
通過沉澱聚合的微凝膠合成涉及（共）單體和交聯劑的直接聚合。通常在沉澱聚合中，在高溫（> 50°C）下使用熱引發劑引發自由基的形成，並在高於其較低的臨界溶液溫度（LCST）的條件下誘導形成的聚合物鏈塌陷，從而形成微凝膠核。通過沉澱新形成的聚合物鏈，微凝膠核進一步生長，並在單體消耗後達到其最大尺寸。
遵循這一想法，Bao等人提出了一種使用反相W/O乳液的交聯劑N，N'-亞甲基雙丙烯醯胺（BIS）進行N，N-二甲基丙烯醯胺（DMAA）的酶促聚合的方法（圖4）。將包含單體，交聯劑以及HRP酶的水相滴加到辛烷相中，該辛烷相包含表面活性劑Tween 20和Span 80以及乙醯丙酮（ACAC）作為自由基介體。加入H2O2後，HRP介導ACAC碳自由基的形成。由於ACAC界面擴散到水相中，可以引發微凝膠的形成。這組作者展示了通過改變BIS的濃度（從而改變微凝膠的平均篩孔大小）可調節的酶活性。但是，這僅在很小的範圍內是正確的。BIS超過0.2 wt％時，酶活性急劇下降。在最佳條件下，與未固定化的酶相比，固定化的HRP保留了其全部活性。作者觀察到了封裝對酶的熱穩定性的明顯影響：在70°C下孵育30分鐘後，固定化的HRP保留了其原始活性的33％，而游離HRP的殘留活性為14％。μ-Gelzymes還顯示出非常高的儲存穩定性，並在3個月後保留了其原始活性的98％（與新鮮固定的酶相比）。
圖4在油包水乳液中DMAA聚合過程中HRP的物理截留。
3.2 反應性聚合物鏈交聯過程中酶的固定化
為了克服在酶存在下沉澱聚合的局限性，引入了兩步微凝膠合成方法。最初，線性（共）聚合物鏈是通過自由基聚合或受控自由基聚合（例如可逆加成-斷裂鏈轉移聚合-RAFT）合成的。Wu等人利用了辣根過氧化物酶（HRP）的作用，這種金屬酶可以使用過氧化氫（H2O2）催化反相細乳液中酚類樹狀聚（甘油）衍生物（dPG）的交聯（圖5）。作者報告稱其裝載效率為40％，相當於每g微凝膠1.64 mg蛋白質。值得注意的是，沒有酶釋放的跡象，並且封裝的HRP表現出改善的熱穩定性。在50°C下孵育42小時後，固定化的HRP保留了其活性的70％（與游離酶相比為10％）。此外，作者證明了不參與微凝膠形成（CalB）的酶的成功共固定化。
圖5. HRP催化的微凝膠交聯以包裹酶。微凝膠配有通過自由基酚偶聯而交聯的酚部分。HRP被截留，可用於進一步催化。
蛋白質被認為是其表面上多個官能團的載體，可以充當微凝膠網絡中的交聯位點。Peng等人使用RAFT聚合來預合成基於甲基丙烯酸N-羥基琥珀醯亞胺酯和環狀N-乙烯基醯胺的聚合物，例如N-乙烯基吡咯烷酮（PVPS），N-乙烯基哌啶酮（PVPIS）和N-乙烯基己內醯胺（PVS）。作者旨在將纖維素酶變體（CelA2_M2）封裝（和交聯）在PVPS微凝膠中，以顯示出更高的比活性和對離子液體的抵抗力。通過在存在於酶表面的賴氨酸的胺基和共聚物中的琥珀醯亞胺側鏈之間形成一個醯胺鍵，在油包水乳液中製備生物雜交微凝膠（圖6）。
圖6.通過反應性聚合物鏈與酶的交聯來包封酶纖維素酶（CelA2_M2）。
4.微凝膠作為可轉換酶載體
4.1 可逆的非共價固定化和觸發的酶釋放
大多數非共價酶固定化策略都集中在酶與微凝膠之間的吸附，超分子，靜電或其他（氫鍵；範德華力）相互作用。
4.1.1刺激響應性微凝膠固定和釋放酶
Sigolaeva等人證明了通過靜電相互作用將酪氨酸酶（來自蘑菇，含銅的多酚氧化酶）固定在PNIPAAm-N，N-二甲基氨基丙基甲基丙烯醯胺（PNIPAAm-DMAPMA）微凝膠中，用於苯酚生物傳感器應用。首先，將微凝膠吸附到導電基質（石墨或金）的薄膜上，而在第二步中，將酪氨酸酶固定在微凝膠中。作者利用pH響應行為來確保酶和微凝膠具有相反的電荷，以實現強烈的靜電相互作用。此外，在微凝膠的溶脹和塌陷狀態下研究了酶的吸附。有趣的是，當酪氨酸酶以塌陷狀態被吸附時，酪氨酸酶的固定效果最好，同時將溫度降低到VPTT以下。隨後的微凝膠再溶脹導致酶被吸入聚合物網絡，例如液體進入海綿。與在膨脹的微凝膠狀態下固定酪氨酸酶相比，後者技術將生物傳感器的靈敏度提高了3.5倍以上。
基於吸附的酶固定化的另一種引人入勝的策略取決於從極性介質到非極性介質的溶劑交換。 Gawlitza等人通過將大量溶劑首先交換為與水混溶的異丙醇，然後交換為與水不混溶的己烷，將脂肪酶CalB固定在PNIPAAm微凝膠中（圖7）。
圖7通過從緩衝水溶液到異丙醇再到己烷的兩步溶劑交換，將CalB截留到PNIPAAm微凝膠中。
4.1.2可逆的酶固定化和通過微凝膠降解釋放除了微凝膠的可切換行為外，可以通過設計可降解的微凝膠網絡來實現酶的觸發釋放。
Peng等人使用RAFT聚合描述了一種使用氧化還原反應系統和降解技術來抑制酶活性的誘人策略。使用RAFT聚合反應製備了吡啶二硫化物官能化的聚（N-乙烯基吡咯烷酮）鏈（PVP-PDS）。隨後的交聯是通過添加不同的多功能巰基末端交聯劑實現的。在交聯步驟中添加了纖維素酶，從而將其封裝在微凝膠網絡中。有趣的是，該酶已經顯示出與線性反應性預聚物的強相互作用，這可以通過賴氨酸殘基的質子化氨基與聚合物鏈的羰基之間的氫鍵形成來解釋。通過交聯預組裝的纖維素酶-聚合物聚集體，可實現高達77％（15.5 mg g-1共聚物）的酶負載效率。與游離酶相比，固定化微凝膠的纖維素酶的酶活性降低了（佔游離酶的4.5–8.8％）。有趣的是，加入二硫蘇糖醇（DTT）後可恢復55％的酶活性，該酶裂解了氧化還原反應性的二硫鍵交聯位點，最終導致微凝膠降解和酶釋放（圖8）。
圖8：通過用不同的多官能硫醇端交聯劑將反應性預聚物（由吡啶基二硫鍵官能化的聚（乙烯基吡咯烷酮）交聯）進行纖維素酶的物理包埋。
6.1 μ-Gelzyme催化的範圍
通常，水解酶（例如纖維素酶，β-gal，脂肪酶）和氧化還原酶（例如HRP，GOx，漆酶）主要用於μ-Gelzyme合成。然而，連接酶（例如Acs），裂解酶（例如DERA）和轉移酶（例如Pk）在文獻中較少出現。
由μ-半乳糖酶催化的反應大部分是在人工底物（例如ATBS，p-NPP，4-MUC）下進行的。相反，較少報導具有天然或非人工底物的μ-Gelzyme生物轉化（使用非人工底物進行的40次固定運動中有13次發生；圖9）。此外，由μ-Gelzymes催化的生物轉化大多是具有低工業重要性的「模型」反應（圖9），這突出表明需要將μ-Gelzymes的範圍擴大到具有可持續大規模技術應用潛力的酶。
圖9.非人工底物的μ-Gelzyme生物轉化概述。
7.從綠色化學角度看μ-半胱氨酸酶
組織討論了μ-半胱氨酸酶對可持續催化的影響以及它們如何符合綠色化學原理。作為方程式的一部分，酶是可持續催化的關鍵因素，因為它們在環境友好的反應條件下以令人印象深刻的化學，區域和立體選擇性進行（生物）化學反應的能力，已經在許多出版物中進行了介紹和評論。微凝膠，特別是它們作為酶載體的應用，尚未就綠色化學原理進行廣泛表徵。可以在水相中合成微凝膠（例如，通過沉澱聚合）並在被認為是安全且對環境有益的溶劑的水中施用。
用於微凝膠合成的E因子對溶劑的質量敏感，因為溶劑的質量主導反應物的質量。通過使反應物的初始濃度增加一倍並保持所有其他條件不變，可以將E因子降低至35，但塌陷的微凝膠的流體力學半徑從175 nm增大到220 nm，增加了25％（圖10）。預期流體動力學微凝膠半徑會增加，因為溶劑的減少會導致單體濃度升高，從而導致微凝膠變得更大。由於流體動力學微凝膠半徑是微凝膠的關鍵質量特性，因此這種變化對於應用而言可能是不可接受的。因此，執行了動態優化，類似於先前報告的優化活動。
圖10通過動態優化（預測反應物濃度變化和流體動力學微凝膠半徑的微凝膠合成機理模型）將PVCL微凝膠合成的E因子最小化，同時將流體動力學微凝膠半徑保持在其原始值的5％以內。
8.未來方向：協同酶工程和微凝膠設計
作者之前嚴格地討論了μ-半乳糖酶的挑戰和局限性，以及它們目前在綠色化學領域中的貢獻和制約因素。簡而言之，一方面，μ-Gelzyme的催化作用受到缺乏大規模應用和與工業相關的反應的限制，但另一方面，μ-Gelzyme的催化作用受到削弱（例如，μ-Gelzymes的活性和耐用性）。為了提高μ-Gelzyme的性能並使它們在工業應用中更具競爭力，從酶和微凝膠的角度出發，必須以集成的方式進行μ-Gelzyme的工程設計（圖11）。
圖11協同蛋白工程和微凝膠設計的概念。
參考文獻：
doi.org/10.1039/D0GC03229H
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