...建立了新方法:Crispr-Cas13a可視化檢測豬繁殖與呼吸症候群病毒...

摘要

豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)在全球養豬業中不斷變異和傳播。豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)的防治是一項複雜的工作。直觀、靈敏、特異的診斷方法有利於PRRS的控制。當LwCas13a的crRNA與目標RNA結合時，LwCas13a的側裂活性被激活來降解非目標RNA。Cas13a的增強檢測是LwCas13a的側裂活性與重組酶聚合酶擴增(RPA)的結合。本研究建立了PRRSV的Cas13a增強檢測方法。該方法是一種37℃的等溫檢測方法，可用於實時分析或可視化。增強Cas13a檢測的檢測極限是172 copies/μl，與豬圓環病毒2、豬細小病毒、豬瘟病毒和偽狂犬病毒沒有交叉反應。增強的Cas13a檢測在臨床樣品中效果良好。

綜上所述，本研究開發了一種基於CRISPR Cas13a的PRRSV核酸的可視化、靈敏、特異的檢測方法。

文章信息：

1 簡介

豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)是全球養豬業中一種具有重要經濟意義的病毒性疾病。豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)是一種單股正鏈RNA病毒，屬小動脈病毒科。PRRSV分為兩個基因型:歐洲基因型(EU型)和北美基因型(NA型)。在中國，NA型PRRSV自1996年起就開始廣泛流行。2006年，中國出現高致病性PRRSV (HP PRRSV)。自2013年以來，NADC30樣PRRSV毒株在中國流行，該毒株屬於NA型PRRSV，在NSP2區域有131個胺基酸不連續缺失。根據ORF5序列，中國NA型PRRSVs被分為5個譜系:譜系1、譜系3、譜系5、譜系8和譜系9。不同PRRSV毒株之間高度的變異和重組使得PRRS的防控更加複雜，給養豬業造成了巨大的經濟損失。

為有效預防和控制PRRS，需要開發一種特異、靈敏、可靠的診斷方法。幾種PRRSV的分子診斷方法已經被報導。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)在病毒檢測中得到了廣泛的應用。RT-PCR和逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)是檢測PRRSV的有效方法;然而，由於依賴於複雜的設備，它不適合用於野外或基層實驗室。利用環介導等溫擴增(LAMP)技術檢測病原體的方法，逆轉錄燈(RT-LAMP)已被開發用於檢測PRRSV。RT-LAMP檢測靈敏度高；然而，RT-LAMP反應中的四種引物使其可靠性降低，可能產生假陽性檢測結果。因此，有必要開發一種靈敏、特異、設備自由、直觀的PRRSV檢測方法。

最近，基於CRISPR Cas13a的檢測已被報導。CRISPR Cas13a可以通過CRISPR RNA (crRNA)和Cas13a的側裂活性來檢測RNA靶標的存在。利用crRNA識別RNA靶標可以激活附近非靶向報告RNA的裂解活性(圖1)。，將重組酶聚合酶擴增(RPA)與T7轉錄擴增的DNA到RNA結合，結合CRISPR Cas13a的間接作用，構建了基於Cas13a的分子檢測平臺（SHERLOCK）。RPA的性能受引物、擴增子長度、模板序列等多種因素的影響是不穩定的；然而，SHERLOCK相當穩定。SHERLOCK可以通過與免疫層析診斷相結合實現可視化。基於CRISPR Cas13a的檢測已成功應用於寨卡病毒(ZIKV)、登革熱病毒(DENV)、禽流感A (H7N9)病毒、伊波拉病毒等分子的miRNA和N1甲基腺苷等分子的檢測。本研究通過RPA與T7轉錄結合增強Cas13a檢測，並利用CRISPR Cas13a的側裂效應，針對保守的PRRSV M基因，對PRRSV進行靈敏、特異、無設備和可視化檢測。

圖1LwCas13a蛋白側裂作用示意圖

2 材料與方法

2.1病毒及臨床樣本

本實驗室分離並保存HP-PRRSV JXA1株和NADC30樣PRRSV-HNjz15株。經典的RRRSV CH-1R株、經典豬瘟病毒(CSFV)和偽狂犬病病毒(PRV)是Pulike生物工程有限公司生產的商業減毒活疫苗。豬圓環病毒2 (PCV2)和豬細小病毒(PPV)由國家獸用藥品工程技術研究中心提供。從幾個省的不同農場收集了37份組織樣本。

2.2核酸製備

PRRSV-JXA1 M陽性DNA片段經PRRSV JXA1 M質粒由BamH I和Hind酶切製備。根據製造商的說明，使用病毒核酸提取試劑盒II (Geneaid)提取PCV2、PRV、PPV和CSFV的病毒DNA或RNA，在無核酸酶的水中洗脫病毒DNA或RNA。根據說明書使用QIAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN)提取PRRSV CH 1R、JXA1、HNjz15和組織樣本的病毒RNA，在無核酸酶水中洗脫病毒RNA。病毒RNA被M-MLV逆轉錄酶(Promega)逆轉錄。所有的DNA和cDNA儲存在-20℃，直到使用。

2.3 RPA引物設計和crRNA製備

參照PRRSV M基因的16個核苷酸序列經DNASTAR比對，確定保守區。在M基因保守的核苷酸區域選擇RPA引物。T7啟動子序列(gaaatTAATACGACTCACTATAggg)附加到RPA前引物的5'端。RPA引物由GENEWIZ合成(表1)

表1 本研究引物序列、crRNA和LF-polyU

對於crRNA的製備，將crRNA的DNA模板加入T7啟動子序列，然後由GENEWIZ合成引物(表1)。利用DNA寡核苷酸退火緩衝液(Beyotime)將兩個引物退火到雙鏈DNA上。雙鏈DNA經凝膠提取純化。根據HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs)的說明書，37℃孵育過夜，將雙鏈DNA轉錄成crRNA。根據製造商的說明書，使用NucAway Spin Columns (Invitrogen)對crRNA進行純化。crRNA儲存在-80℃。

2.4 LwCas13a的表達和純化

LwCas13a蛋白的純化與已經報導的一樣，只是做了一些修改。將pC013雙鏈SUMO huLwCas13a質粒轉化入Rosetta TM (DE3) pLysS單體感受態細胞(Millipore)。將16 ml過夜培養物加入4 L肉湯培養基(TB)中，37℃培養至OD600升高至0.6。在培養液中加入500 μM IPTG（最終濃度），並在18℃誘導蛋白質表達16小時。然後，在3000 g，20 min離心，並在80℃下保存。使用溶菌酶(Sigma)，完全無EDTA蛋白酶抑制劑混合物(Roche)，苯甲酸酶核酸酶(Sigma)的裂解緩衝液(250mm NaCl, 20mm Tris HCl, 1mm DTT, pH 8.0)重懸細菌。然後，懸浮液在冰上超聲，離心。上清液經0.22μm過濾器過濾後，用Ni固定化金屬親和層析純化。蛋白洗脫液經4℃裂解液透析過夜。透析後，用SUMO蛋白酶(ThermoFisher) 4℃消化過夜。利用HiTrap SP FF柱(GE Healthcare Life Sciences)，AKTA PURE (GE Healthcare Life Sciences)對蛋白進行進一步純化。最後，使用含有350 mM、400 mM、450 mM和520 mM NaCl的洗脫緩衝液(20 mM Tris-HCl，5% glycerol，1 mM DTT，pH 8.0)洗脫蛋白。Cas13a蛋白儲存在-80℃。

2.5增強Cas13a檢測

增強的Cas13a檢測包括RPA和含有T7轉錄的Cas13a檢測。對於RPA，根據TwistAmp基本工具包(TwistDx)的指示，在50μl反應體系中於37℃下擴增1μl cDNA或DNA。Cas13a檢測是按照之前報導進行，只是做了一些修改。50μl Cas13a反應系統包括5μlRPA擴增產物、22.5nM crRNA、45nM Cas13a、2μl核糖核酸酶抑制劑（New England Biolabs）、125 nM RNAreporter（RNAse Alert v2, Thermo Scientific）、0.6μl T7 RNA聚合酶混合物（New England Biolabs）、2.5μlNTP緩衝液混合物和Cas13a檢測緩衝液（60 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, pH 7.3）。在485nm激發波長和520nm發射波長下，37℃下進行2.5小時的螢光動力學實驗。每5分鐘讀取一次螢光值。

Cas13a檢測與親和層析檢測，在50μl的cas13a反應體系中，RNA報告物(RNAse Alert v2, Thermo Scientific)被合成的FAM RNA生物素報告物（最終濃度為1 μM）取代。Cas13a檢測在37℃下進行，持續1小時。將20μlcas13a檢測產品轉移到100μl雜交檢測緩衝液中，然後將Milenia HybriDetect 1 Dipstick (TwistDx)放入溶液中。孵育5分鐘後，用相機對試紙進行拍照。

3 結果

3.1 LwCas13a的表達和純化

使用500μM IPTG，18°C，16小時表達誘導LwCas13a蛋白。收集細胞，超聲破碎和離心。Coomassie染色結果顯示，標記蛋白表達的LwCas13a主要在上清液中(圖2a)。Ni柱親和層析純化後，用SUMO蛋白酶消化標記蛋白LwCas13a，再用AKTA純化的HiTrap SPFF柱純化。純138.5 kD LwCas13a蛋白經400mm NaCl洗脫緩衝液洗脫，Coomassie染色測定(圖2b)。

圖2LwCas13a蛋白的Coomassie染色

3.2增強型Cas13a螢光檢測的驗證

為了驗證所表達的LwCas13a蛋白的活性，我們對完整的Cas13a反應體系和不含LwCas13a蛋白的Cas13a反應體系進行了評價。以陽性片段JXA1-M為模板進行RPA檢測，將RPA擴增產物加入有或無LwCas13a蛋白的Cas13a反應體系中進行螢光動力學檢測。如圖3a所示，完整Cas13a反應體系的相對螢光單位(RFU)隨著時間的增加而迅速增加，直至達到峰值，而沒有LwCas13a蛋白Cas13a反應體系中沒有反應。結果表明，表達的LwCas13a對鄰近的非靶向報告基因RNA具有側裂活性。用增強的Cas13a螢光檢測三株PRRSV (CH-1R, JXA1, HNjz15)。三株PRRSV的RFU均隨時間迅速升高，直至達到峰值，而陰性對照無反應(圖3b)。結果表明，增強的Cas13a螢光檢測可用於PRRSV的檢測。

圖3增強型Cas13a螢光檢測PRRSV的分析

3.3增強Cas13a螢光檢測的特異性和敏感性

用JXA1-M和CSFV、PPV、PCV2、PRV等病毒檢測Cas13a螢光增強的特異性。JXA1-M發生快速反應，與其他病毒無交叉反應(圖4a)。結果表明，增強的Cas13a螢光檢測可用於PRRSV的特異性檢測。

增強Cas13a螢光檢測的敏感性測試，JXA1-M模板10倍比稀釋，如圖4b所示，七個數量級從1.7108copies/μl到1.7102copies/μl模板可以被探測到。這些數據表明，增強Cas13a螢光檢測的檢測極限是172opies/μl。

圖4增強型Cas13a螢光檢測的特異性和敏感性

3.4增強Cas13a螢光檢測在臨床樣本中的應用

為了驗證增強型Cas13a螢光螢光檢測技術在臨床樣品中的應用，採用增強型Cas13a螢光螢光檢測技術和RT-qPCR技術從不同農場採集了37份組織樣品。32例組織標本為PRRSV陽性，5例為Cas13a螢光增強檢測陽性。RT-qPCR是根據製造商的使用手冊通用RT-qPCR試劑盒(Anheal)進行的。RT-qPCR檢測結果與增強的Cas13a螢光檢測結果一致(表2)。這些數據表明，增強的Cas13a螢光檢測可用於臨床樣品。

表2增強型Cas13a檢測及RT-qPCR檢測臨床標本

3.5增強Cas13a免疫層析檢測的驗證

為便於現場可視化檢測，建立了增強型Cas13a免疫層析檢測系統。在增強的Cas13a檢測中，使用了FAM RNA生物素報告基因LF polyU進行免疫層析檢測。陰性樣品中，金粒抗FAM抗體與高濃度FAM RNA生物素報告基因充分結合，結合物在對照條帶被生物素配體攔截。對於陽性樣本，FAM RNA生物素報告基因被裂解，金粒抗FAM抗體的偶聯物FAM在檢測條帶積累，而在對照條帶積累減少。免疫層析檢測的原理圖如圖5a所示。用增強的Cas13a免疫層析儀分析了三種不同的PRRSV株(CH 1R、JXA1和HNjz15)。如圖5b所示，三個PRRSV株的免疫層析檢測條帶均出現明顯的陽性條帶。結果表明，增強的Cas13a免疫層析檢測可以實現PRRSV的可視化檢測。

圖5增強Cas13a免疫層析檢測PRRSV的分析

3.6增強Cas13a免疫層析檢測的特異性和敏感性

為了評估增強的Cas13a免疫層析檢測的特異性，我們對包括CSFV、PPV、PCV2和PRV在內的病毒進行了分析。4種病毒的免疫層析檢測條帶均無陽性，而陽性僅在JXA1-M免疫層析檢測條帶上出現(圖6a)。為了分析增強的Cas13a免疫層析檢測的靈敏度，我們測試了上述10倍連續稀釋的JXA1-M(圖6b)。增強的檢測極限Cas13a免疫層析檢測172copies/μl，這與增強型Cas13a螢光檢測的靈敏度一致。因此，增強型Cas13a免疫層析檢測可以用於PRRSV的特異性和敏感性檢測。

圖6增強型Cas13a免疫層析檢測的特異性和敏感性

3.7增強Cas13a免疫層析檢測在臨床樣本中的應用

增強Cas13a免疫層析檢測用於分析上述37個組織樣本。32例組織標本為PRRSV陽性，5例標本經免疫層析檢測為PRRSV陰性(表2)。增強Cas13a免疫層析檢測與增強Cas13a螢光檢測及RT-qPCR在臨床標本中檢測結果一致。這些數據表明，增強的Cas13a免疫層析檢測可以用於臨床現場PRRSV的檢測，而不需要昂貴的設備。

4 討論

豬繁殖呼吸症候群病毒是養豬業重要的經濟致病原之一，可引起妊娠母豬流產、呼吸系統症狀、豬死亡等。自1996年首次在中國發現PRRSV以來，PRRSV在全國範圍內廣泛傳播，並且不斷發生變異，使得PRRS的防控更加困難。已有建立的幾種PRRSV的檢測方法。以抗原抗體反應為基礎，用簡單設備進行現場檢測，但該方法的靈敏度較低。基於核酸的檢測方法，如PCR和RT-qPCR，可以檢測出高靈敏度的PRRSV，但這些檢測需要昂貴的設備，不適合設備簡陋的實驗室或現場診斷。因此，需要開發一種基於核酸的、設備簡單的PRRSV檢測方法。

本研究提出了一種基於CRISPR Cas13a的新型核酸檢測方法，用於PRRSV的檢測。為了確定合適的靶區，對一組北美PRRSV基因組進行了比對和分析。根據比對結果，設計了保守PRRSV M基因的RPA引物和crRNA。本研究中LwCas13a的純化策略與以往的研究存在一定的差異；然而，通過不同方法純化的LwCas13a均具有令人滿意的活性。

增強Cas13a檢測PRRSV有很高的特異性和靈敏度，檢出極限為172 copies/μl。在Spear, A的研究中，RT-qPCR的檢測限為100copies/reaction。在Lin CN的研究中，RT-qPCR的每個反應的檢測限約為100copies/reaction。新方法的靈敏度與RT-qPCR相似。增強的Cas13a檢測已成功應用於多個省不同農場採集的臨床樣本。

這種新方法有以下特點：

首先，增強的Cas13a檢測不僅可以應用於螢光檢測樣品的分析，還可以與免疫層析檢測相結合進行可視化，既可以應用於實驗室，也可以應用於現場。

其次，增強的Cas13a檢測具有穩定性。雖然RPA的效率是可變的，受到引物、模板的核苷酸序列等因素的影響，但是Cas13a的側裂活性可以彌補RPA的低效率，使增強的Cas13a檢測達到令人滿意的反應活性。

第三，將RPA特異性擴增與crRNA特異性序列鑑定相結合，使增強的Cas13a檢測更具特異性。第四，在37℃條件下設計並實現了增強型Cas13a檢測，使其易於在裝備較差的實驗室或現地使用。

綜上所述，本研究建立了一種基於CRISPR Cas13a的PRRSV可視化核酸檢測方法。這種新的方法可以提供一種檢測PRRSV的替代工具，對設備要求較低，特別適用於資源貧乏的地區。

文章僅代表作者觀點

翻譯組眾朋博士翻譯

組長周盼伊審核整理

歡迎加《中國動物保健》新媒體總監周盼伊微信交流畜牧獸醫研究進展