【藍耳病病毒】2015-2017年我國豬繁殖與呼吸症候群流行毒株遺傳變異分析
【公眾號】中國藍耳病網2018-07-16 15:47:37
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豬繁殖與呼吸症候群（Porcine reproductiveand respiratory syndrome
豬繁殖與呼吸症候群（Porcine reproductiveand respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，臨床上主要以各年齡豬的呼吸道症狀和妊娠母豬晚期流產、早產，產弱仔、死胎或木乃伊胎為特徵。我國 PRRS 疫情於 1995年底首先發生在華北地區的規模化豬場，繼而短時間內迅速傳遍全國。自 2006 年以來，我國又出現了高致病性 PRRSV，並對我國養豬業造成了巨大經濟損失。
GP5 是 PRRSV 的主要結構蛋白之一，屬於病毒的囊膜糖蛋白，能夠誘導產生具有保護作用的中和抗體，並在病毒誘導細胞凋亡和識別細胞表面受體等方面發揮著極其重要的生物學功能。美洲型和歐洲型毒株的 GP5 蛋白分別為 200 和 201 個胺基酸，含有 2~4 個糖基化位點和一段 31 個胺基酸的信號肽。GP5 蛋白具有較好的免疫原性，且其誘導的中和抗體出現之後，抗血清主要識別 GP5 蛋白。有研究表明，抗 GP5 抗體的效價跟血清對病毒的中和作用呈正相關。本研究通過對 2015—2017年所分離的 PRRSV GP5 基因序列進行分析，為當前 PRRS 防疫及研究提供一定的理論基礎。
1、材料與方法
1.1 病毒樣品
2015—2017 年全國 15 省 份 58 株 PRRSV 感染的臨床樣品。
1.2 主要試劑
RNA 提取試劑盒：購於 TAKARA 公司；高保真反轉錄（RT）試劑盒：購於羅氏公司；LATaqDNA 聚合酶：購於寶生物工程（大連）有限公司。
1.3 檢測與測序
按照文獻介紹的 RT-PCR 方法進行檢測。利用病毒 RNA 提取試劑盒提取總 RNA，用 RT 試劑盒進行反轉錄反應。ORF5 引物為：上遊：CATTTCATACACCTGAGACCAT；下遊：AGATCATATATCATCACTGGCT。
反應條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃15 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共 32 個循環，68 ℃延長 10 min；15 g/L 凝膠電泳，150 V，25 min。將RT-PCR 產物送大連寶生物公司進行測序。
1.4 分子進化分析
利用序列分析軟體 DNA star Lasergene，對所選毒株 ORF5 基因進行序列比對，分析其同源性，利用 MEGA6 軟體製作進化樹。
2、結果與分析
2.1 RT-PCR 檢測
對所檢測樣品 GP5 基因進行 RT-PCR 檢測，檢測到773 bp的目的條帶，表明所檢樣品均為PRRSV（圖1）。
1~3. 陽性樣品；4. 陰性對照；M. DNA 標準 DL 2000
圖 1 RT-PCR 檢測結果
2.2 分離毒株與代表毒株進化樹
對 58 株野毒株 GP5 基因進行序列分析發現，以 VR2332 MLV 為代表的第一亞群有 6 株，以TJ2006/JXA12006/HUN42008 為代表的第四亞群 35株，以 NADC30 為代表的第五亞群 11 株，新亞群6 株，沒有分離到以 CH1R/CH1A 為代表的第二亞群，以及以HB1/HB2為代表的第三亞群毒株（圖2）。
2.3 分離毒株與標準毒株間核苷酸及胺基酸同源性分析
將分離的野毒株核苷酸與標準毒株核苷酸，通過 DNASTAR 進行同源性對比發現：與第一亞群在同一分支的 6 株野毒株與第一亞群同源性 為 93.7%~99.3%，與其他亞群同源性為83.1%~91.4%；與第四亞群在同一分支的 35 株野毒株與第四亞群同源性 為 94.9%~99.7%， 與其他亞群同源性為 83.3%~94.4%； 與 NADC30為代表的第五亞群在同一分支的 11 株野毒與第五亞群同源性為 94.2%~99.7%，與其他亞群同源性為 82.3%~90.2%；6 株新亞群之間的同源性為 93.7%~99.2%，與其他亞群同源性為82.1%~85.6%。
■為疫苗毒株（作為參考毒株）
圖 2 PRRSV 分離株遺傳進化樹
胺基酸對比發現：6 株第一亞群野毒株與代表毒株 VR2332 同源性為 92.8%~98.9%，與其他亞群同源性為 81.8%~89.3%；第四亞群 的 35 株野毒與代表毒株 TJ-F92、JXA1 等同源性為 93.1%~99.4%，與其他亞群同源性為 82.7%~95.1%；11 株第五亞群與代表毒株NADC30 同源性為 94.1%~98.9%，與其他亞群同源性為 81.3%~89.1%；新亞群 6 株野毒之間同源性為 93.2%~97.85%，與其他亞群同源性為81.6%~85.3%。
2.4 胺基酸序列進化分析
與 PRRSV GP5 相關的毒力位點為胺基酸第13 和 151 位。以 VR2332 為代表的第一亞群毒株毒力位點為 R13、R151，以 CH1R 為代表的第二亞群毒株毒力位點為 R13、R151，以 HB-2 為代表的第三亞群毒株毒力位點為 R13—Q13，以JXA1/TJ2006 為代表的第四亞群毒株毒力位點為R13、R151，以 NADC30 為代表的第五亞群毒株毒力位點為 Q13、K151。分離的第一亞群 6 株野毒株中，有 2 株（YN-1509/HeNXX-1704）的第 13位點為 Q13，其他均為 R13；第四亞群的 35 株野毒株的第 13 位點均為 R13；第五亞群 11 株野毒株的第 13 位點，除 HeB-JZ-1610 為 P13 外，其他均為 Q13；6 株新亞群野毒中，FJSM-1705 為 R13，FJ-15091/gx-15-11/gx-yl-1504 為 Q13，JX-1705/SH-1705 為 P13。6 株分離的第一亞群毒株胺基酸 151位 點 中，HENXX 為 G151，其他為 R151；第四亞群中，11 株為 R151，其他為 K151；分離的 11株第五亞群毒株中，FJZZ-1609 為 R151，其他為K151；分離的 6 株新亞群均為 K151。
PRRSV 胺基酸序列的中和表位是位於第37~44 位的 SH（F/L）QLIYN，其中 F/L39 為中和抗體的表達位點。以 VR2332 毒株為代表的第一亞群為 L39，以 CH1R 毒株為代表的第二亞群為 F39，以 HB-2 毒株為代表的第三亞群為 F39，以 TJ2006/JXA1、HUN4 毒株為代表的第四亞群為 I39，以NADC30 毒株為代表的第五亞群為 L39。2015—2017 年所分離的 58 株野毒株中，6 株第一亞群野毒株的中和抗體位點為 L39，35 株第四亞群野毒株中和抗體位點為 I39，11 株第五亞群中和抗體的位點為 L39，6 株新亞群中和抗體的位點為 S39。
對於3個N- 糖基化位點（N33、N44 和N51），N33 有變化，N44 與 N51 沒有變化。標準毒株中，第一亞群為 N33，第二亞群為 N34，第三亞群 N34，第四亞群中的代表毒株均為N34N35，第五亞群的代表毒株均為 N34S35。2015—2017 年分離的毒株中，有 6 株為第一亞群，其中 SDLY-1706/SDYT-1706 第 33 位點為 S33，其他 4 株 為N33。35 株第四亞群中，LNSY-1708/JL-16/YNKM-1707/SDDY-1612 為 S35，其他 31 株為 N35；第 34位點變化較大的有 N34、G34、S34。11 株第五亞群中，第 34、35 位胺基酸位點均為 N34S35。6 株第六亞群中第33、34、35位胺基酸位點均為G33N34S35（圖3）。
圖 3 2015—2017 年分離 PRRSV 株胺基酸分析
3、討論
自 2006 年江西省暴發高致病性 PRRS 疫情後，PRRSV 由於感染壓力及自然選擇，其基因序列不斷發生變異和重組，從而使該病防控成為難題。目前有效的疫苗免疫仍是防治 PRRS 的最有效手段。PRRSV GP5 基因編碼的蛋白是 PRRSV 主要的免疫原性蛋白，是刺激機體產生中和抗體的重要蛋白。在 2015—2017 年分離的 58 株 PRRSV 毒株中，有 6 株屬於以 VR2332 為代表的第一亞群，35 株屬於以 JXA1/TJM-F92 為代表的第四亞群，11 株屬於 NADC30 為代表的第五亞群，6 株屬於新亞群。由此可以發現，我國 PRRSV 毒株存在易變異和多樣性等特點，並且所分離毒株並沒有嚴格的地域差異，這為 PRRS 的防疫帶來了更大挑戰。
囊膜糖蛋白 GP5 在 PRRSV 感染的細胞內雖然表達水平較低，但它卻是主要的免疫原性蛋白。在不同毒株間，GP5 蛋白是各結構蛋白中變異最大的，其胺基酸位點變化可以改變中和抗體效果。在 2015—2017 年所分離的 58 株野毒株中，6株第一亞群野毒株中和抗體位點為 L39，35 株第四亞群野毒株中和抗體位點為 I39，11 株第五亞群中和抗體位點為 L39，6 株新亞群中和抗體的位點為 S39。由此可推斷中和表位在不斷變化並逐步變異。GP5 蛋白一些主要位點的變異並無地域性差異，隨著時間的推移和基因亞型的改變，中和保護位點也在不斷發生變化。從 2015—2017 年的分離株基因分析來看，GP5 蛋白第 151 位毒力位點發生的變化較大，由第一亞群 R151 向第六亞群 K151 轉變，這與李廣興等的研究一致。野毒株 R151 變異主要影響PRRSV 中和抗體抑制病毒的效果，但關於病毒毒力的影響尚未見報導。由此推測，不同地方分離毒株間存在一定的毒力差異；GP5 蛋白第 151 位毒力位點的不同導致不同亞群 GP5 抗體抑制 PRRSV 的能力存在差異。關於 3 個 N- 糖基化位點（N33、N44 和 N51）的變化，N33 變化較大，而 N44 與 N51 則沒有變化。由此推斷，N- 糖鏈糖基化位點也在變異，但是這個突變是否影響病毒毒力，有待進一步證實。
4、結論
通過以上結果可以得出以下結論：我國PRRSV 毒株呈多亞群共存，不同亞群毒株毒力及中和保護位點存在差異，同一亞群毒株毒力及保護位點也有差異。這些基因序列的變化為該病防疫帶來了較大壓力。因此，針對 PRRS 防控，必須進行田間毒株的檢測和基因分析，然後選擇相應基因型毒株疫苗進行免疫，切勿盲目選擇疫苗，以免造成經濟損失。
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