作為領先的基因捕獲解決方案提供商，艾吉泰康會接到形形色色的基因捕獲的定製需求。其中有一類恰好是當下非常火熱的單細胞相關的。很多客戶諮詢，單細胞，或者少量細胞擴增後的DNA如果拿來做捕獲測序，需要注意哪些問題呢？今天，小艾將相關問題匯總整理一下。
在介紹單細胞捕獲之前，先將單細胞DNA擴增技術做一個簡單的整理：
Ⅰ DOP-CPR[1] or PEP[2]
基於簡併引物或者15nt完全隨機引物的擴增，技術均發表於1992年，目前有成熟的商業化試劑盒。
Ⅱ MDA[3]
基於Phi29聚合酶和隨機六鹼基引物的等溫擴增，發表於2002年。目前仍在使用。有兩個方向的技術改進，一個是將單細胞的DNA分散至大量的微液滴中（eMDA[4]和ddMDA[5]），另一個是使用特殊的引發酶（TruePrime[6]）。兩個改進均提高了擴增的均一性。
Ⅲ MALBAC[7]
謝曉亮老師組2013年發表，PCR產物形成發卡結構，抑制後續的PCR擴增，可以較好解決擴增不均一的問題。
圖一 三種單細胞擴增方法原理圖示[8]
Ⅳ LIANTI[9]
謝曉亮老師組2017年發表，基於Tn5轉座酶連接上帶有T7啟動子序列的接頭，並採用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄來擴增核酸。
圖二 LIANTI技術原理示意圖[9]
Ⅰ 真實有效深度
人是二倍體生物，單個細胞的染色體拷貝只有2個。因此，單細胞擴增產物在測序時，不論測序深度是多少，原始的DNA分子來源都是2個。如果是生殖細胞，則只有1個拷貝。而普通的測序中，每1X的深度都代表一個原始的DNA分子（因為去dup，多重擴增子除外）。這是單細胞測序最大的不同之處。
Ⅱ DNA產物總量問題
LIANTI的產物總量較少，謝曉亮老師的論文中提到，有20ng左右。片段長度的分布則受到Tn5轉座酶插入時的間隔的影響。MDA的DNA產出較多，能達到μg級別甚至10μg級別，且長度能達到kb級別。二代測序有低起始量建庫試劑盒，這個DNA的總量是足夠的；如果是三代建庫，LIANTI的總量還是不夠，需要增加擴增產量。
Ⅲ 覆蓋度問題
這個是在分析時會帶來最大麻煩的地方。有些檢測需求的擴增模板是少量細胞，也有些檢測需求是真·單細胞的擴增，比如胚胎植入前檢測，擴增用的模板來自一個細胞的DNA，那麼考慮到細胞擴增前的分選和處理，很難保證DNA沒有斷點。這種斷點的位置，是無法擴增出來的。既然無法擴增出來，也就無法檢測到這個斷點附近的序列。比如謝曉亮老師的論文中提到，在25X的平均測序深度下，不同的方法的全基因組覆蓋度有72%左右的，也有85%~93%的。我們檢測的客戶樣本也看到了類似的現象，用全外檢測（平均深度約100X），覆蓋度高的可以超過90%，低的也有百分之二三十的。
Ⅳ 均一性問題
單細胞DNA必須經過擴增，而PCR是有不均一性的。事實上，根據LIANTI的論文，單細胞擴增的均一性很難達到和bulk cells樣本一致的水平。因此，在測序結果中，過分強調均一性指標（0.2X mean depth coverage或者Fold 80罰分），會發現這類指標都很差，而原因並非是捕獲層面的，更多的是因為樣本本身的不均一程度就很高。
圖三 不同單細胞擴增技術的擴增均一性比較[9]
Ⅴ Duplication問題
一般的捕獲測序，我們認為dup主要來自於PCR過程，並不提供樣本的真實信息。在單細胞DNA測序時，由於必須進行DNA擴增，因此建庫時的DNA全部都是擴增產物。分析時去除dup，可以消除建庫、捕獲時的PCR不均一對鹼基分型頻率的影響，但需注意，檢測結果中的分型頻率偏差是無法通過去dup來消除的。這個偏差來自擴增時的不均一性和捕獲時的偏差兩個層面，其中主要的影響因素是擴增的不均一。
好啦，以上是小艾總結的單細胞DNA擴增產物做捕獲測序時可能存在的問題，歡迎大家繼續提問~
1. Telenius H , Carter N P , Bebb C E , et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.[J]. Genomics, 1992, 13(3):718-725.
2. Zhang L, Cui X, Schmitt K, et al. Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992, 89(13): 5847-5851.
3. Dean F B, Hosono S, Fang L, et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(8): 5261-5266.
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5. Sidore A M, Lan F, Lim S W, et al. Enhanced sequencing coverage with digital droplet multiple displacement amplification[J]. Nucleic acids research, 2016, 44(7): e66-e66.
6. Picher A J, Budeus B, Wafzig O, et al. TruePrime is a novel method for whole-genome amplification from single cells based on Tth PrimPol[J]. Nature communications, 2016, 7(1): 1-16.
7. Zong C, Lu S, Chapman A R, et al. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J]. Science, 2012, 338(6114): 1622-1626.
8. Gawad C, Koh W, Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(3): 175.
9. Chen C, Xing D, Tan L, et al. Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI)[J]. Science, 2017, 356(6334): 189-194.
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