生物谷：轉錄，這一將DNA的遺傳信息通過信使RNA的互補合成傳遞下去的過程，組成了所有細胞活性的基本構成。但是有關這一過程的動力學，比如這一過程有效性有多高？能進行多久？這些問題至今我們了解得很少。來自阿爾伯特·愛因斯坦醫學院（Albert Einstein College of Medicine）解剖學與結構生物學系，法國科學研究基金會（Fonds Nationaux de la Recherche Scientifique），以色列Bar-Ilan大學的研究人員利用一種先進的顯微技術同步測量了轉錄的步驟，這一從未實現過的實驗得到了令人驚訝的結果，從基礎上改變了目前已知的轉錄過程。
這一研究成果公布在Nature Structural & Molecular Biology網絡版上。
轉錄（Transcription）是蛋白質生物合成的第一步，也是tRNA和rRNA的合成步驟。
轉錄中，一個基因會被讀取被複製為mRNA，就是說一特定的DNA片段作為模板，以DNA依賴的RNA合成酶作為催化劑的合成前體mRNA的過程。這一DNA指導的RNA合成作用以DNA為模板，在RNA聚合酶催化下，以四種三磷酸核苷（NTP）即ATP、GTP、CTP及UTP為原料，各種核苷酸之間的3′、5′磷酸二酯鍵相連進行的聚合反應。合成反應的方向為5′→3′。反應體系中還有Mg 2+、Mn 2+等參與，反應中不需要引物參與。鹼基互補原則為A-U、G-C，在RNA中U替代T與A配對。
RNA聚合酶是催化轉錄作用的酶，原核生物與真核生物都有各自的RNA聚合酶，原核生物RNA聚合酶的結構是由五個亞基組成，為二條α鏈，一條β鏈，一條β′鏈和一條σ因子鏈，α 2ββ′四個亞基組成核心酶，加上σ因子後成為全酶α 2ββ′σ；真核生物中已發現有四種RNA聚合酶，分別稱RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Mt。
其中 RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成hnRNA和mRNA，是真核生物中最活躍的RNA聚合酶。
RNA聚合酶Ⅲ轉錄的產物都是小分子量的RNA，tRNA的，5SrRNA的和snRNA。
RNA聚合酶Ⅰ轉錄產物是45SrRNA，生成除5SrRNA外的各種rRNA。
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Mt
定位
轉錄產物
核仁
5.8S，18S，28SrRNA前體
核質
mRNA前體
U1、U2、U4、U5
SnRNA前體
核質
tRNA前體
5SrRNA前體
U6SnRNA前體
線粒體
線粒體 RNAS
對利福平的敏感性利福黴素
不敏感 (-)
敏感 (+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(+)
這一最新研究就是圍繞著RNA聚合酶II進行的，在轉錄過程中，DNA附近會聚集越來越多的RNA聚合酶II，然後RNA聚合酶II就會通過特異性互補作用合成RNA。
為了觀測到這一轉錄過程，研究人員利用活體哺乳動物細胞——每一個細胞都包含著研究人員插入到細胞染色體中的一個人工基因的200個拷貝。然後通過將螢光標籤加在RNA聚合酶II上，研究人員就能夠觀測到轉錄過程的三個步驟了：酶分子結合綁定到DNA上，啟動（當酶與第一個RNA核苷結合在一起）和延伸（RNA分子剩餘部分的延伸）。當研究人員觀測RNA聚合酶II分子與DNA結合，並製造出新的RNA的時候，他們發現酶分子結合上去後會立即脫落下來。
文章作者 Robert Singer博士表示，「令人驚訝的一項發現就是，轉錄過程實際上效率十分低，尤其在開始的兩個步驟」，「這說明結合到基因上的聚合酶只有1%幫助合成RNA，轉錄是一個效率低的過程。我們還不肯定這是什麼原因，但是這也許是由於轉錄過程中需要的所有因子都要在正確的時間，正確的地點聚集在一起，因此需要酶不斷的脫落，又不斷的補充上去，直到所有的元素都精確到位。」
研究人員觀察到轉錄的結合過程持續大約6秒，啟動則需要54秒，而比較而言，轉錄的延伸過程則需要長達517秒（大約8分鐘）。研究人員認為可能的原因就是：「先鋒」聚合酶有時會「停頓」一段較長的時間，延遲轉錄過程，就像狹長的街道上，一輛車擋住了後面所有的車。但是一旦過了這一停頓過程，延伸過程就變快了——大約每秒70個核苷合成，這比之前報導的要快的多。
這兩個過程：停頓和延伸過程中快速的RNA合成，也許是調控基因表達的關鍵過程。Singer博士認為，「利用這種機制，就算突然出現什麼狀況，你都可以應付自如」，「一旦這一停頓酶重新開始，那麼就能以極高的速度合成突然急需大量特異性蛋白的mRNA。」
參予這一研究的還包括第一作者：Xavier Darzacq（目前在法國科學研究基金會），Yaron Shav-Tal（目前在以色列Bar-Ilan大學），Valeria de Turris 和Shailesh M. Shenoy。
原始出處:
Nature Structural & Molecular Biology
Published online: 5 August 2007; | doi:10.1038/nsmb1280
In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription
Xavier Darzacq1, 2, Yaron Shav-Tal1, 3, Valeria de Turris1, Yehuda Brody3, Shailesh M Shenoy1, Robert D Phair4 & Robert H Singer1
1 Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York 10461, USA.
2 Laboratoire de Génétique Moléculaire, Centre National de la Recherche Scientifique, UMR-8541, Ecole Normale Supérieure, 75005 Paris, France.
3 The Mina & Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, Ramat Gan 52900, Israel.
4 Integrative Bioinformatics, Inc., Los Altos, California 94024, USA.
Correspondence should be addressed to Robert H Singer rhsinger@aecom.yu.edu
We imaged transcription in living cells using a locus-specific reporter system, which allowed precise, single-cell kinetic measurements of promoter binding, initiation and elongation. Photobleaching of fluorescent RNA polymerase II revealed several kinetically distinct populations of the enzyme interacting with a specific gene. Photobleaching and photoactivation of fluorescent MS2 proteins used to label nascent messenger RNAs provided sensitive elongation measurements. A mechanistic kinetic model that fits our data was validated using specific inhibitors. Polymerases elongated at 4.3 kilobases min-1, much faster than previously documented, and entered a paused state for unexpectedly long times. Transcription onset was inefficient, with only 1% of polymerase-gene interactions leading to completion of an mRNA. Our systems approach, quantifying both polymerase and mRNA kinetics on a defined DNA template in vivo with high temporal resolution, opens new avenues for studying regulation of transcriptional processes in vivo.
Figure 1. Detecting transcription in vivo using fluorescence microscopy
(a) Schematic of the gene cassette17 stably integrated into chromosomes of human U2OS cells. P above protein sequence denotes Pol II phosphorylation state (red, phosphorylated). Reverse tet transactivator (rtTA) in the presence of doxycycline drives gene expression from a minimal CMV promoter17. Arrows indicate the 3.3-kb region transcribed by Pol II and the 2.3-kb region labeled by GFP-MS2 fusion proteins. Red lines indicate targets of FISH oligonucleotide probes. (b–m) Active transcription sites recruit Pol II. In b,e,h,k, RFP-LacI labels gene locus. Immunofluorescence (using indicated antibodies) reveals Pol II in three phosphorylation states: unphosphorylated (c), phosphorylated at Ser5 (f) and phosphorylated at Ser2 (i). l shows that the transcription site recruits YFP–Pol II (YFP-RPB1Amr). In n–y, nascent mRNAs were detected at active sites. In n,r,v, CFP-LacI labels gene locus. In o,s, mRNAs bound by GFP-MS2 were detected by FISH (probes at 5' and 3' ends are shown in p,t). FISH signals at exon (w) and intron regions (x) colocalize only at transcription site (see merge of each row, q,u,y). Scale bars, 5 m.
全文連結：http://www.nature.com/nsmb/journal/vaop/ncurrent/full/nsmb1280.html
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