[科普]PCR檢測的原理

2021-01-17 MartinView

前言：


在南航航班，熔斷！一文中，筆者曾對旅客核酸檢測進行過分析：

「從需求層面來看，理論上講，如果這種檢測可以在國內航班普及，那麼勢必對國內旅行信心恢復有著極大的提升，雖然伴隨著非常顯著的成本。」


在6月18日，民航局再次發文，要求「做好疫情常態化防控準備」。在這樣的大背景下，疫情防控再次上升到了國家安全層面。而航空旅行作為聯通各大城市的重要方式，可能會成為病例輸入的方式。目前應對高風險地區的航班，各地區要求出具7天內的核酸檢測證明，或進行14天隔離。可見，目前Martinview 於14日提出的核酸檢測除了「恢復信心」外，還對疫情防控有著重大作用。那麼，目前進行的核酸檢測的原理是什麼？需要多久出結果？結果是否準確呢？


不做核酸，無法「隨心」   攝影：Martin Ma


本文由 Ray Liang 投稿，從技術角度探討了目前北京採用的聚合酶鏈式反應（PCR）核酸檢測的原理，耗時及邊際成本。


Disclaimer: 本文是基於生物原理的分析，目的是在理論上討論可行性，對現實不具有明確的指導意義。筆者和投稿作者支持國務院和民航局執行一切和防疫相關的政策。除特殊許可外，本文內容及所有圖片嚴禁轉載。




1、提取樣品


如今醫護人員的取樣方式分為鼻咽取樣和口咽取樣兩種，顧名思義就是拿棉籤往被試者的鼻子或者口腔深處裡「捅」並刮擦，提取口腔或鼻腔中的黏液，送回實驗室檢測。


左圖：鼻咽取樣示意圖  右圖：口咽取樣示意圖，伸進扁桃體刮擦下壁


2、進行檢測


取完樣品之後，先提取試子中的RNA，再逆轉錄為cDNA，最後用PCR進行擴增，觀察螢光圖像即可得到結果。說到PCR擴增檢測就不得不提最重要的兩個元素：引物和分子探針。


引物的作用就相當於門口的保安，去分辨誰可以進入擴增的行列。核酸檢測的引物是特異性的，通過新冠病毒和其他已知病毒進行基因對比分析，找出新冠病毒最獨特的一段基因序列，並通過A－T、C－G對應法則進行設計。而又因為DNA的擴增必須要引物才能進行，特異性的引物就可且只可讓新冠的基因進行擴增，達到之後檢測的目的。


而PCR擴增時,除了加入一對引物還會同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

 

左圖為陰性，右圖為陽性
Thornton B, Basu C. Rapid and simple method of qPCR primer design. Methods Mol Biol. 2015;1275:173-179. doi:10.1007/978-1-4939-2365-6_13


接下來就會觀察螢光圖像，如果試子中有新冠的基因，即人已染病，DNA就會成指數型擴增，並在後期形成平臺期。而如果出現雙峰的情況，即下圖，說明引物不具有特異性（因為擴增了兩種基因），該檢測無效。


雙峰說明引物不具有特異性  Source: Bbioo.com


3、潛在風險

現在有一部分檢測人員在做口咽拭子的時候沒有把測試用品深入咽喉，使得用品上沾染的病毒濃度可能會出現不夠的風險，從而使PCR無法擴增病毒導致假陰性的出現，也就是不會在圖像上出現峰值，所以不會被判定為得病。

 

4、價格

排除設計引物的投資，核酸檢測試劑盒的邊際成本非常低，也就是說設計完引物，併購買一臺幾萬塊錢的QPCR儀器後，只需要幾塊錢的成本就能進行一個人的核酸篩查。



總結：


Ray的科普可以簡單總結為：取樣-提取-轉錄-擴增。這套技術已經相對成熟，並且伴隨著較低的邊際成本。


Source:

Thornton B, Basu C. Rapid and simple method of qPCR primer design. Methods Mol Biol. 

2015;1275:173-179. doi:10.1007/978-1-4939-2365-6_13



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