上海藥物所今年第8篇世界三大頂刊：徐華強團隊再發Nature

2020-09-25 生物世界

2020年9月23日，中科院上海藥物所徐華強課題組與美國溫安洛研究所Peter Jones課題組、Karsten Melcher課題組合作，在 Nature 雜誌在線發表了題為：Structure of nucleosome-bound DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B 的研究論文。這也是上海藥物所2020年發表在三大頂刊 Cell、Nature 和 Science 上的第8篇論文。


研究團隊利用Cryo-EM技術首次解析了de novo DNA甲基轉移酶DNMT3A2/DNMT3B3和天然底物核小體的高解析度結構，闡述了DNMT3A2/DNMT3B3與核小體的結合模式，提出了全基因組DNA甲基化的模型。

DNA甲基化可以改變染色質結構、DNA穩定性及DNA與蛋白質等相互作用，從而控制基因表達。DNA甲基化可隨DNA的複製過程遺傳給新生的子代DNA，是一種重要的表觀遺傳機制。在染色質環境中，DNA的甲基化要比在溶液中複雜得多，核小體作為遺傳物質的組成單位，包裹在其外圍的DNA更加難以被甲基化。

然而，大多數核小體結合的de novo DNA甲基轉移酶處於非激活狀態。de novo DNA 甲基化轉移酶3A和3B催化的CpG甲基化對哺乳動物的發育和細胞分化至關重要，並且常常與癌症的發生密切相關。

通過對大量正常組織（GTEx資料庫）和癌症組織（TCGA資料庫）中不同亞型DNMT的表達分析，本研究以人類癌症中主要的兩種DNMT亞型DNMT3A2和DNMT3B3與核小體核的相互作用為重點。

目前，DNMT3A催化結構域和DNMT3L類催化結構域以及其與游離DNA的晶體結構已經解析，然而由於其局限性， DNMT與其天然底物核小體的相互作用機制並未得到闡述。

為了揭示DNMT3A2/3B3與核小體的相互作用並了解染色體上DNA甲基化，通過四年多的不懈努力，團隊利用冷凍電鏡技術成功解析DNMT3A2/3B3和核小體複合物近原子解析度的冷凍電鏡結構。

該結構顯示，異源四聚體複合物（3B3-3A2-3A2-3B3）與分離的DNMT3A催化結構域和DNMT3L類催化結構域複合物非常相似，但是卻非對稱地和核小體相互作用。DNMT3B3類催化結構域之一錨定在核小體的酸性補丁（acidic patch）區域，其作用核心區域為DNMT3B3 740位和743位的精氨酸指（Arginine finger）。核小體酸性補丁區域與多種核小體結合蛋白都有至關重要的相互作用。然而，DNMT3A2催化結構域並不與核小體核心區域相互作用，而是隨著DNA的路徑，與一端的連接DNA（linker DNA）相互作用並催化其CpG甲基化。儘管DNMT3家族蛋白具有高度的保守性，通過DNA結合的DNMT3A2和核小體核心區域結合的DNMT3B3的結構對比，揭示了目標識別區域（TRD）結構域的開關功能。在所有具有催化活性的DNMT3亞型中，都含有對目標DNA作用至關重要的TRD結構域，雖然其在空間上阻斷了催化結構域與核小體核心區域相互作用，但是增強了DNA的結合能力。

a. 複合物結構的冷凍電鏡電子密度圖；

b. 酸性補丁相互作用；

c. DNMT3A2 催化結構域與連接DNA相互作用和DNMT3B3類催化結構域與核小體核心相互作用。

為了驗證酸性補丁相互作用對核小體募集的重要性，研究團隊對精氨酸指（R740和R743）進行了突變分析，並以遠離酸性補丁區域的胺基酸（K745和R749）作為對照。

體外相互作用實驗（ALPHA Screen）顯示，相互作用核心區域740和743精氨酸指相反電荷的突變顯著減弱了DNMT3A2/3B3與核小體的相互作用，而非核心區域或者相同電荷的突變則如預期，結合能力沒有顯著變化。

細胞內染色質結合能力實驗（chromatin association assay）也證實與酸性補丁相互作用740和743精氨酸指的突變導致與染色質的結合顯著降低。DNA甲基化陣列（Infinium MethylationEPIC BeadChip）同樣證實了DNMT3B3與核小體酸性補丁之間的相互作用對於體內DNA甲基化重建的重要性。突變體DNMT3B3恢復DNA甲基化的能力和其與染色質的結合能力密切相關。作為對照的K745和R749突變，甲基化恢復水平幾乎與野生型DNMT3B3一樣。相反，顯著降低與染色質結合的R740E和R743E突變，甲基化恢復效率低得多。

有限的微球菌核酸酶消化實驗（MNase digestion）進一步證實了存在DNMT複合物的情況下，核小體的任一側都顯著增加了約10 鹼基對的保護區域。這些數據強烈支持DNMT複合物的類催化結構域與酸性補丁相互作用對於核小體募集和DNA甲基化的重要性，並且與DNA的結合併不依賴於酶的活性位點CpG。

a. AlphaScreen實驗測定His標記的DNMT3A2-DNMT3B3複合物與生物素標記的NCP相互作用。

c. DNMT3 染色質結合實驗。

d. HCT116細胞和DKO8共轉DNMT3B3細胞的CpG位點的甲基化熱圖。

e. 箱形圖顯示了109,998個探針的DNA甲基化水平分布。

總之，DNMT3A2/3B3與核小體複合物的結構以及功能分析揭示了DNMT3B3類催化結構域出乎意料的核小體靶向功能，將DNMT3A2/3B3催化結構域定位在核小體連接DNA區域，這對於全基因組DNA甲基化非常重要。

通過DNMT類催化結構域和催化結構域將DNMT核心核小體靶向和CpG甲基化分離，可以將DNMT3複合物募集到難以接近的核小體附近，同時將CpG甲基化靶向連接DNA區域。這表明，在體內將DNA甲基化傳播至核小體DNA需要核小體核的重塑，例如通過DNA複製、轉錄或其他核小體重塑事件。

該項工作由2016年作為上海藥物所和溫安洛研究所的交流生徐廷海（藥物所2017屆博士畢業生，目前為美國溫安洛研究所Peter Jones組、Karsten Melcher組共同博士後）在藥物所導師徐華強和溫安洛研究所Peter Jones、Karsten Melcher的指導下開展。

徐廷海為本文第一作者。中國科學院上海藥物所徐華強與美國溫安洛研究所Peter Jones，Karsten Melcher為本文的共同通訊作者。

論文連結：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2747-1

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