急性單核細胞白血病細胞系

THP-1細胞系是從一名患有急性單核細胞白血病的1歲小男孩的外周血中分離得到的，自1980年建系以來，THP-1細胞被廣泛用於單核細胞和巨噬細胞相關的機制、信號通路以及營養和藥物運輸等研究中。相對於U937、HL-60、ML-2等白血病細胞系，THP-1更有類似人原代單核細胞的形態和功能特徵（包括細胞分化標記）。相對於人外周血單核細胞（PBMC），THP-1更易在實驗室中培養和擴增，且具有更穩定的基因背景，不存在PBMC的個體差異性問題，利於實驗結果的重現。因此，THP-1是各大實驗室常用的急性單核細胞白血病細胞系，是研究免疫和炎症的理想工具。

基因敲入：

CRISPR-U基因敲入THP-1細胞：

通過核轉染法將gRNA、Cas9和Donor共轉入細胞中，gRNA和Cas9複合物造成靶位點DNA雙鏈斷裂後，細胞以攜帶敲入片段的Donor作為模板進行同源重組修復（HDR），將敲入片段重組到基因組靶位點。

CRISPR-U可以通過核轉染法高效地將CRISPR/Cas9以及Donor載體共轉入THP-1細胞中，篩選後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出成功敲入的陽性克隆。若敲入的是螢光蛋白等報告基因，也可以通過直接觀察螢光進行初步篩選。

應用案例：

通過建立基因敲除和敲入的THP-1細胞模型，明確胞內抗病毒反應的信號通路

DNA通常定位於細胞核中，而異常定位在胞漿中的DNA與通常與病毒感染或腫瘤發生有關。cGAS-cGAMP-STING信號通路可檢測胞漿dsDNA的存在，並誘導強效的免疫反應，產生幹擾素和激活其他免疫應答基因。與之對應的，RIG1-MAVS可以檢測胞漿內的pppRNA（一類dsRNA，某些病毒的基因組），並誘導免疫應答。有時候胞漿內會出現RNA和DNA的雜交複合物，這種分子通常在某些病毒感染的情況下出現。為了研究這種RNA-DNA複合物是通過哪個通路激活免疫應答，研究者分別構建了MAVS、cGAS、STING敲除的THP-1細胞，分別將dsDNA、pppRNA、RNA-DNA複合物導入細胞，發現RNA-DNA複合物是通過cGAS-cGAMP-STING通路進行免疫激活。

隨後，研究者通過CRISPR/Cas9技術將2A-GLuc敲入到IFIT1基因座，使其受IFIT1的啟動子驅動表達，IFIT1是一個典型的幹擾素激活表達的基因。後續實驗顯示，導入RNA-DNA複合物後，由於幹擾素的表達，激活了IFIT1啟動子驅動GLuc的表達。這些結果進一步證明了胞漿的RNA-DNA複合物是通過cGAS-cGAMP-STING信號通路激活免疫反應，為抗病毒研究提供了思路[5]。

CRISPR-U可以通過使用通過核轉染法高效地將gRNA、Cas9和Donor共轉入THP-1細胞中，篩選後挑取單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出基因敲入的陽性克隆，構建符合您特定研究需要的基因敲入細胞系模型。

參考文獻：

Mankan A K, Schmidt T, Chauhan D, et al.Cytosolic RNA: DNA hybrids activate the cGAS–STING axis[J]. The EMBOjournal, 2014, 33(24): 2937-2946.

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