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文章解讀：Tiger
文章校對：生信寶典
Summary:Single-cell technologies have described heterogeneity across tissues, but the spatial distribution and forces that drive single-cell phenotypes have not been well defined. Combining single-cell RNA and protein analytics in studying the role of stromal cancer-associated fibroblasts (CAFs) in modulating heterogeneity in pancreatic cancer (pancreatic ductal adenocarcinoma [PDAC]) model systems, we have identified significant single-cell population shifts toward invasive epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and proliferative (PRO) phenotypes linked with mitogen-activated protein kinase (MAPK) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling. Using high-content digital imaging of RNA in situ hybridization in 195 PDAC tumors, we quantified these EMT and PRO subpopulations in 319,626 individual cancer cells that can be classified within the context of distinct tumor gland 「units」 Tumor gland typing provided an additional layer of intratumoral heterogeneity that was associated with differences in stromal abundance and clinical outcomes. This demonstrates the impact of the stroma in shaping tumor architecture by altering inherent patterns of tumor glands in human PDAC.
研究背景單細胞技術可以描述不同組織之間的異質性，但驅動單細胞表型的空間分布和條件是不太相同的。結合單細胞轉錄組和蛋白組學研究間質癌相關成纖維細胞（CAFs）在調節胰腺癌（胰腺導管腺癌[PDAC]）模型系統異質性中的作用，作者發現了明顯的細胞群體之間的轉化，包括：侵襲性上皮-間質的轉化（EMT）和增殖（PRO）與絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路和信號轉導轉錄激活子3 （STAT3）信號通路有關。作者在195個PDAC腫瘤中使用高內涵數字成像觀察RNA的原位雜交，在319,626個個體癌細胞中對EMT和PRO亞群進行定量。腫瘤腺體分型提供了更為詳細的腫瘤內異質性分型，且該分型與基質豐度和臨床結果的差異有關。這證明了基質通過改變人PDAC中腫瘤腺體的固有模式來改變腫瘤結構的影響。
研究方案Sample: 92 PDAC and 92 CAF cells across conditons;
作者分別用已經經過螢光標記的細胞系GFP-螢光素酶胰腺癌細胞系（PDAC-3）和mCherry CAF細胞系（CAF-1）以不同的比例（100:0,50:50,30:70,10:90）進行共孵育（實驗設計真是值得學習，說實話我們如果設計該實驗時，應該不會設計10:90這個比例，總感覺CAF細胞太多可能會影響胰腺癌細胞與CAF細胞之間的互作。。。）；
單細胞建庫流程：SMART-Seq
測序數據分析介紹工具: SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing-v3 kit;
比對: hg38 genome(GRCh38.79) using the STAR v2.4.0h alinger with default settings.
篩選：Genes with fewer than 10 reads in fewer than 5 samples were excluded from analysis, as were samples with fewer than 7000 genes with 5 or more reads.
基因差異分析：作者並沒有利用單細胞的分析流程，直接進行了轉錄組的差異分析（DESeq2）;(從作者的描述語言中，哈哈其實可以看出作者並不擅長生物信息分析，所以寫的都比較「詳細」 （寫的其實不太規範化），可能有人會覺得是不是測序深度較深所以作者應用了DESeq2進行差異分析，也可能是這樣的，哈哈哈，但我不信。生信寶典註：方法描述還是挺細緻的，參數和原理的都有描述，用的DESeq2是作者優化後的，說作者不擅長生信分析是有些誤解。 通訊作者Martin J. Aryee是統計學、表觀研究方向的，生信分析經驗應該比較多。只是有一點在轉錄組分析中不太常用,未見作者的解釋：Duplicate reads were marked using the MarkDuplicates tool in picard-tools-1.8.4 and were removed.）
基因富集分析：Gene set enrichment analysis using Broad Institute MsigDB v5.0;
結果分析(1) 與PDAC細胞共培養的CAF細胞導致患者衍生的PDAC細胞系中EMT和PRO表型的單細胞轉錄異質性;為了理解基質微環境對PDAC細胞轉錄程序的影響，作者利用GFP-螢光素酶胰腺癌細胞系（PDAC-3）和mCherry CAF細胞系（CAF-1）來分離每種細胞；以不同比例（50:50,30:70和10:90 PDAC:CAF）共培養PDAC細胞和CAF 72h後，進行scRNA-seq測序；作者發現一組186個差異表達的基因，51個基因下調 (PDAC only)，而135個基因響應於CAF共培養而上調 (PDAC:VAF=10:90)。GSEA分析發現這些基因集富集在PRO (HALLMARKE2F_TARGETS) 和EMT (HALLMARK
EPITHELIAL_ MESENCHYMAL _TRANSITION)通路，其代表性基因表達如圖C；作者發現在共培養條件為10:90的PDAC:CAF條件中存在PRO和EMT（DP，雙陽性）表型的癌細胞亞群；在沒有CAFs的情況下，65％的PDAC細胞是PRO、EMT雙陰性（DN）表型，而在50:50的PDAC:CAF共培養條件下，PDAC細胞從這種DN狀態轉變為PRO，EMT單陽性或雙陽性細胞的混合物；將100%CAFs與50:50 PDAC：CAF條件下進行差異分析產生3,059個差異表達基因（FDR <0.2），其中2,158個基因上調，901個基因下調。其中，PDAC細胞上調的基因富集在增殖功能的相關通路上，CAF細胞上調基因特異性富集在炎性幹擾素反應相關通路。（其實炎性的間質細胞並不是特別新的東西，但利用單細胞層面對腫瘤細胞的炎症環境進行分析是一個既相對簡單又重要的研究課題）
MET和PRO定義：The genes used for the Proliferation (Pro) and EMT meta-signatures were chosen as the 15 genes from the HALLMARK_E2F_TARGETS and HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL _TRANSITION gene sets that
had the most negative median correlation with genes of the other gene set. Meta-signature scores for each cell were calculated as the mean expression rank for the 15 genes that comprise the given meta-signature.（常用表徵方式，值得學習和借鑑）
(2) CAF條件培養基（CAF-CM）（其實就是CAF分泌的因子）對不同的PDAC細胞系的PRO和EMT表型的影響;作者發現在三種不同的CAF-CM中均發現了相對較高的PRO和EMT表型的細胞，並且作者在免疫缺陷小鼠中注射入不同比例PDAC-3和CAF細胞組成的胰腺原位腫瘤，並使用體內螢光素酶成像進行體內觀察，發現10:90 PDAC：CAF腫瘤中原發腫瘤生長明顯更快（4周時與對照組相比大7.9 3），但在30:70 PDAC：CAF中沒有腫瘤；與單獨的PDAC細胞相比，在PDAC：CAF原位腫瘤中觀察到增加的轉移性腫瘤負荷。（作者只是想說明基質的變化將會導致腫瘤轉錄發生變化，導致增殖能力和轉移能力明顯增加）
(3) CAF-CM激活不同PDAC細胞系的DP細胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），並激活信號轉導子和轉錄激活子3 （STAT3）信號通路;鑑於在CAF-CM存在下PDAC細胞向EMT和PRO表型轉變，作者想要鑑定由於CAF-CM暴露而在PDAC細胞中激活的途徑中的信號。在5分鐘，15分鐘，1小時，3小時和24小時對暴露於CAF-CM的PDAC-3細胞進行基於時程且基於質譜的磷酸化蛋白質組學實驗。該實驗揭示了EMT和PRO蛋白質網絡的顯著富集，包括MAPK途徑的早期活化（MEK / ERK）隨後在24小時有關STAT3通路的基因表達上調（STAT3）。
(4)CAF分泌的轉化生長因子b（TGF-β）驅動PDAC細胞系中的DP表型;作者對無血清CAF-CM和無血清PDAC-CM進行了質譜分析並比較了CAF和PDAC分泌蛋白組學，發現TGF-β1是PDAC細胞系中增殖能力獲得的重要貢獻者。並且作者利用RNA-ISH確定了在原發性PDAC腫瘤中的EMT和PRO的表型；
(5) 基質含量與人原發性PDAC腫瘤中腫瘤腺體的不同模式相關;不同細胞類型（DP，EMT，PRO和DN）對患者預後結果的影響是不同的，同時也表明存在不同的腫瘤腺體類型。作者根據其腫瘤腺體細胞組成定義了8種不同類型的腫瘤腺體並且發現人類PDAC腫瘤中基質含量與腺體異質性確實存在相關性。作者觀察到不同基質含量下含有不同細胞類型（DP，EMT或PRO）的腺體類型的富集：DP腺體（I型）僅在高基質腫瘤中富集，中基質腫瘤中EMT腺體（II型和IV型）低基質腫瘤PRO腺體（III型）中顯著富集。並且作者發現發現腫瘤主要含有DP或EMT細胞的腺體（I型，II型，和IV）與惡化的患者生存率顯著相關。
單細胞文章點評該篇文章總感覺不是通過單細胞測序篩選出的調控基因的up和down，作者很有可能是做完了後面的實驗後發現利用單細胞測序可以幫助文章提高檔次，所以就利用了單細胞測序；
作者沒有利用單細胞的分析思路，只是利用了普通轉錄組的基因差異分析；（其實，如果你細看Cell Immunity的文章的話，你會發現大部分都是這樣的，單細胞分析確實可以幫助提高檔次）
作者的設計實驗的思路是值得好好學習的，尤其是在以不同比例的腫瘤細胞和間質細胞混合後查看差異分析，用這樣的方法，多數的腫瘤其實都是值得做一做的；（比如肺癌與其間質細胞的關係，甚至可以做肺癌-間質細胞-炎症的關係，或者有許多其他腺癌，肺中的間質細胞類型較多）
在應用單細胞測序時，最重要的就是實驗設計，不要等到已經做完測序N多錢投了出去，發現實驗設計有問題。當實驗設計不合理的時候，為了充分利用數據，我們總會想到去分新亞群，當往往找出的亞群沒有實質意義，不是和代謝有關，就是和分裂有關，沒有特異性功能方面的作用。（勸大家不要總抱著找新亞群的想法，要去找同一群裡的不同細胞的異質性）
這篇文章其實也是通過模擬腫瘤環境來找部分分子功能的，我忽然想起了一篇設計簡單，但很有趣的文章，大家可以看一看！這篇文章是耶魯大學吳殿青組在Developmental Cell上發表的文章，題目是 《Leukocyte cytoskeleton polarization is initiated by plasma membrane curvature from cell attachment 》
參考文獻Ligorio M, Sil S, Malagon-Lopez J, Nieman LT, Misale S, Di Pilato M, Ebright RY, Karabacak MN, Kulkarni AS, Liu A, Vincent Jordan N, Franses JW, Philipp J, Kreuzer J, Desai N, Arora KS, Rajurkar M, Horwitz E, Neyaz A, Tai E, Magnus NKC, Vo KD, Yashaswini CN, Marangoni F, Boukhali M, Fatherree JP, Damon LJ, Xega K, Desai R, Choz M, Bersani F, Langenbucher A, Thapar V, Morris R, Wellner UF,Schilling O, Lawrence MS, Liss AS, Rivera MN, Deshpande V, Benes CH, Maheswaran
S, Haber DA, Fernandez-Del-Castillo C, Ferrone CR, Haas W, Aryee MJ, Ting DT.Stromal Microenvironment Shapes the Intratumoral Architecture of Pancreatic Cancer. Cell. 2019 May 23. pii: S0092-8674(19)30510-0. doi:10.1016
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