基本信息
5 月 9 日，上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院普外科黃陳主任醫師作為通訊作者，在 Molecular Cancer（IF 10.679）發表了題為「Circular RNA circCCDC9 acts as a miR-6792-3p sponge to suppress the progression of gastric cancer through regulating CAV1 expression」研究論文，系統研究了環狀 RNA circCCDC9 在胃癌進展中的作用機制。
這也是繼去年 8 月份之後（可點擊查看詳情）
，該課題組再次在 Molecular Cancer 上發表胃癌領域 circRNA 研究成果。文章中全轉錄組測序服務工作由歐易生物完成。
研究背景
胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，由於對早期胃癌的篩查不足和疾病的隱匿性，多數患者初診即已處於胃癌晚期。目前胃癌的預後仍不盡人意，因此探究胃癌發生發展的具體分子機制，對於胃癌的診治具有重要意義。
環狀RNA（circular RNA, circRNA）是真核生物中一類重要的內源性非編碼 RNA，近些年研究表明 circRNA 廣泛參與腫瘤的發生和發展，影響腫瘤的生長增殖和侵襲轉移等過程。以胃癌為例，circNHSL1 就是一個與胃癌轉移相關的 circRNA 分子，通過 circNHSL1/miR-1306-3p/SIX1 軸調控了胃癌轉移。但胃癌中 circRNA 的作用和功能仍有待深入研究。
研究結果
1、circCCDC9 在胃癌組織中表達下調
首先對 6 個胃癌樣品和配對的癌旁樣品進行全轉錄組測序，共檢測到 12450 個 circRNA，在腫瘤組織中有 52 個 circRNA 表達上升、33 個表達下降（下左圖）。其中表達下調最為顯著的一個 circRNA 是 Has_circ_0000944，它由基因 CCDC9 外顯子 6 和外顯子 7 反向剪接形成，因此將此 circRNA 命名為 circCCDC9。
利用 RT-PCR 在 48 個胃癌樣品中進行檢測（右上圖）、利用原位雜交（ISH）在 54 個胃癌樣品中進行檢測，均顯示該 circRNA 表達量發生了顯著下調。與正常胃上皮細胞系相比，不同的胃癌細胞系中 circCCDC9 表達量也明顯降低（右下圖）。circCCDC9 表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期呈負相關，與胃癌患者預後呈正相關。
為了證明 circCCDC9 是環狀 RNA，利用 divergent 和 convergent 兩對引物，並通過一代測序（下圖 A）、以 cDNA 和 gDNA 為模板進行 PCR（下圖 B）、RNase R 處理（下圖 C）的方法得以驗證。亞細胞定位顯示 circCCDC9 主要分布於細胞質中。
2、circCCDC9 在體外可以抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲
為了研究 circCCDC9 在胃癌中的作用，在 MKN45 細胞中利用 siRNA 對 circCCDC9 進行 knockdown，但不影響 CCDC9 mRNA 的表達水平（圖 B）；在 AGS 細胞中過表達 circCCDC9（圖 C）。knockdown circCCDC9 後，結果顯示細胞增殖能力增強（圖 D-F），wound healing 和 transwell 實驗顯示細胞的遷移、侵襲能力也得以增強（圖 G-H），過表達 circCCDC9 則呈現相反趨勢。
3、miR-6792-3p 在胃癌中高表達並與腫瘤進展和預後相關
為了研究 circCCDC9 對胃癌的調控機制，並考慮到 circCCDC9 主要分布於細胞質中，文章從 ceRNA 的角度進行探索。首先利用生物信息分析的手段預測有 5 個 miRNA 可以靶向到 circCCDC9，RT-PCR 顯示只有其中的 miR-6792-3p 在細胞和組織中均與 circCCDC9 表達量呈負相關（圖 B-D）。分析也顯示 miR-6792-3p 與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期呈正相關，與胃癌患者預後呈負相關（圖 G）。
4、miR-6792-3p 通過靶向 CAV1 促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲
接下來研究 miR-6792-3p 的作用。多個軟體共同預測顯示 miR-6792-3p 可能靶向的基因有 6 個，其中的 CAV1 是一個已報導的與胃腸道癌進展相關的基因。在胃癌細胞系中轉入 miR-6792-3p mimic 以提高 miRNA 表達量，RT-PCR 顯示 CAV1 表達量顯著下降（圖 B）。同時利用螢光素酶報告系統檢測顯示，miR-6792-3p 可以與 CAV1 序列直接結合，而不能結合鹼基突變的 CAV1（圖 C-D）。檢測結果還表明，miR-6792-3p 過表達後，腫瘤細胞增殖能力增強，細胞的遷移、侵襲能力也得以增強。而通過轉入 miR-6792-3p inhibitor 降低表達量則呈現相反趨勢。
5、circCCDC9 作為 miR-6792-3p 的分子海綿以調控 CAV1 的表達
上述結果表明在胃癌進展中，circCCDC9、miR-6792-3p、CAV1 都有變化，接下來研究它們三者之間的調控關係：
1）RT-PCR 和 WB 顯示，knockdown circCCDC9 可以下調 CAV1 的 mRNA 和蛋白質表達水平，下調 miR-6792-3p 可以挽救 CAV1 的上述表達下降（圖 A）。同樣，過表達 circCCDC9 可以上調 CAV1 的 mRNA 和蛋白質表達水平，上調 miR-6792-3p 可以抑制 CAV1 的上述表達上升（圖 B）。
2）螢光原位雜交顯示，circCCDC9 與 miR-6792-3p 共定位於細胞質（圖 C）。
3）螢光素酶報告實驗表明，miR-6792-3p 可以直接結合 circCCDC9，而不能結合含突變鹼基的 circCCDC9（圖 D）。
4）RIP-PCR 顯示，靶向 Ago2 蛋白的抗體可以同時 pull down 到 circCCDC9 和 miR-6792-3p（圖 F-G）。
5）生物素標記的 circCCDC9 探針可以 pull down 到 miR-6792-3p，生物素標記的 miR-6792-3p 探針也可以 pull down 到 circCCDC9（圖 H-I）。
6）RT-PCR 顯示，胃癌組織中，circCCDC9 與 CAV1 表達正相關、circCCDC9 與 miR-6792-3p 表達負相關、CAV1 與 miR-6792-3p 表達負相關。
7）同時細胞實驗證實，由 circCCDC9 所引起的腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的改變，可以被 miR-6792-3p 所抑制。
以上結果表明 circCCDC9 通過直接結合 miR-6792-3p 以上調 CAV1 表達，以 ceRNA的機制參與對胃癌腫瘤進展的調控。
6、體內過表達 circCCDC9 可以抑制腫瘤生長與肝轉移
以上均是在體外進行的研究，接下來為了研究 circCCDC9 在體內是否起到同樣的調控作用，將過表達 circCCDC9 的 AGS 細胞接種到裸鼠。接種 28 天后，過表達 circCCDC9 的裸鼠腫瘤體積與重量顯著低於對照組（圖 A-C），RT-PCR 顯示 CAV1 表達量顯著高於對照組。構建肝轉移模型，顯示過表達 circCCDC9 的裸鼠肝轉移程度較低。
研究結論
本研究通過全轉錄組測序，發現了一個胃癌進展相關的 circRNA 分子——circCCDC9，體內體外實驗表明，它對腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲起到抑制作用。進一步的機制研究表明，circCCDC9 對胃癌的抑制作用是通過 circCCDC9/miR-6792-3p/CAV1 軸實現的：circCCDC9 作為 ceRNA，競爭性結合 miR-6792-3p，從而間接調控了 CAV1 的表達水平。circCCDC9 和 miR-6792-3p 均有望成為胃癌預後的 biomarker，為胃癌的診斷和治療提供了新的分子靶點。
參考文獻
Luo Z, Rong Z, Zhang J, et al. Circular RNA circCCDC9 acts as a miR-6792-3p sponge to suppress the progression of gastric cancer through regulating CAV1 expression. Mol Cancer 2020; 19(1): 86. (IF: 10.679).
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鄭小辮兒 撰文
本文系歐易生物原創
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