snoRNA登頂《Nat. Med.》:SNORA31罕見突變削弱皮層神經元的天然免疫導致單純皰疹病毒性腦炎發生

美國洛克菲勒大學人類傳染病基因遺傳實驗室Shenying Zhang團隊，在Nature Medicine雜誌上發表題為Human SNORA31 variations impair cortical neuron-intrinsic immunity to HSV-1 and underlie herpes simplex encephalitis 的研究論文，該研究發現SNORA31通過一種獨特的機制控制中樞神經系統神經元對HSV-1的抗病毒固有免疫反應。單純皰疹病毒1型（HSV-1）腦炎（HSE）是典型的散發性疾病。儘管少見，HSE卻是西方國家甚至全球最常見的偶發性病毒性腦炎。在未得到及時治療的情況下,HSE的死亡率達100%。目前臨床上普遍採用阿昔洛韋治療HSE，然而HSE倖存者都表現出嚴重的神經系統後遺症。該研究團隊一直致力於病毒性感染疾病發病的遺傳基礎研究，前期發現了TLR3和DBR1介導的中樞神經系統細胞內源性免疫的先天性錯誤可分別導致前腦和腦幹HSE【1，2】。儘管如此，大多數HSE患者的突變基因仍然未知。基於此，該研究團隊提出以下假設：一些患者由於中樞神經系統內在免疫力的先天性缺陷而發展為HSE，但這些缺陷基因並不一定與TLR3-IFN-α/β通路有關。研究團隊採用全外顯子組測序技術分析205名彼此無血緣關係的HSE患者的基因，並將2756例無病毒感染性疾病的和1511例資料庫的正常人基因作為比對，發現在HSE患者中的一些基因存在罕見的雜合突變，其中SNORA31的雜合突變在HSE群體中顯著富集 (P=0.00029；OR：11.4；95%置信區間：3.5-32.9)。SNORA31雜合突變具有四種，其中n.36T>C(V1，P1來自摩洛哥，P2來自沙烏地阿拉伯)，n.75C>G(V2，P3來自美國)，n.96T>G(V3，P4來自法國)和n.111T>C(V4，P5來自葡萄牙)(圖1.a)。然而有6個健康親屬也為SNORA31雜合突變(圖1.b)，但4個呈血清HSV-1抗體陽性。隨後研究團隊採用GERP++方法分析發現SNORA31的保守程度為所有snoRNA中的Top 5% (圖1.c)。SNORA31是核仁小RNA 的一種，前期研究推測SNORA31可能指導核小RNA和核糖體RNA中尿苷殘基異構化為偽尿苷【4】。這四種SNORA31突變體的突變核苷酸均為高度保守的位點。突變體V1(P1，P2)所在位點為在14種脊椎動物中高度保守的核苷酸(78%保守)，而V2(P3) 所在位點為的核苷酸（100%保守）。V3(P4)和V4(P5)都位於snoRNA二級結構的莖內(圖1d)，而V3(P4)和V4(P5)位於環中，前者突變所在位點的核苷酸(64%保守)，而後者在預測的功能結構域中改變嚴格保守的核苷酸(100%保守)。最後通過gnomAD計算這四種突變體和所有其他49種變體的SNORA31二級結構的最小自由能變化(圖1e)。變異體V1和V2是最不穩定的十個變異體之一，而V3和V4被預測不會對RNA結構產生任何顯著的影響。

SNORA31突變後對自身的影響：

為了開展SNORA31的後續實驗研究，研究者構建了野生型和突變型SNORA31的表達載體。然而qPCR和RNA blot都發現V1和V2突變體的表達水平遠遠低於野生型(圖2. a-c)。隨後使用CRISPR-CAS9獲得 SNORA31雜合和純合缺失的人胚胎幹細胞(HESC)系並分化TBR1陽性（TBR1是皮層神經細胞的標誌）的CNS神經元群體。由於SNORA31位於TPT1的第5內含子，因此也對這TPT1的表達進行了分析。雜合缺失的神經元有50%低水平的SNORA31表達，而純合缺失的細胞顯示完全喪失表達(圖2.d)。TPT1的mRNA和蛋白質水平在兩種細胞系中都是正常的(圖2.d)。作為對照的另一個H/ACA類snoRNA SNORA34在所有等基因系中的表達水平與親本相當。SNORA31在V1和V2突變體患者來源的成纖維細胞中表達也受到抑制（圖3.a）。

考慮到SNORA31可能指導核小RNA和核糖體RNA中尿苷殘基異構化為偽尿苷【3】，包括18S rRNA中的U218位點和28S rRNA中的U3713位點。隨後對來源於親本、SNORA31缺失雜合子和純合子等品系的hESC 來源的CNS皮層神經元的rRNA進行了偽尿嘧啶圖譜測序分析(Pseudo-Seq)，結果顯示在SNORA31純合缺失細胞中，U218位點的假尿嘧啶信號幾乎消失（圖2.e）。SNORA31的雜合缺失對rRNA假尿苷酸化無顯著影響。出乎意料的是，28S rRNA的U3713位點沒有受到影響。因此，SNORA31突變在HSE發病中起作用可能涉及或不涉及U218的偽尿苷化。SNORA31突變的成纖維細胞抗病毒固有免疫響應水平如何：研究團隊檢測患者來源的成纖維細胞對TLR3和IFN-α/β受體激動劑的免疫響應水平。在Poly(I：C)刺激下，來自P2-P5的SV40成纖維細胞能誘導產生正常水平的IL-29(IFN-λ1)和IL-6 (圖3b)。P2-P5來源的成纖維細胞對HSV-1感染高度敏感，並且 HSV-1(Kos株)的複製水平與TLR3或STAT1缺陷患者細胞中的水平相似或更高 (圖3C)。然而外源性幹擾素IFN-β使SNORA31-和TLR3-而不是STAT1突變的神經元對HSV-1產生抗性(圖3d)。進一步表明SNORA31突變是一種不同於TLR3和STAT1缺陷的HSE的新機制。然而SNORA31的雜合缺失似乎並不影響EBV-B細胞和IPSCs的抗HSV-1免疫功能，這表明並不是所有的人類細胞類型都需要完整的SNORA31表達和功能來控制HSV-1。除了HSV-1外，SNORA31突變細胞對其他病毒的感染也相當敏感，包括水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、麻疹病毒(MeV)、脊髓灰質炎病毒(MAPV)、水皰性口炎病毒(VSV)和腦心肌炎病毒(EMCV)。除脊髓灰質炎病毒外，這些病毒在SNORA31突變患者來源的成纖維細胞中的複製水平高於健康人來源的細胞，在TLR3或STAT1缺陷細胞中也觀察到了同樣的現象（圖4）。

SNORA31突變的神經元對HSV-1感染的敏感性如何變化：最後研究者還發現SNORA31突變的患者hPSC衍生的皮質神經元易受HSV-1的影響：患者的iPSC衍生的皮質神經元對HSV-1的敏感性顯著增強（圖5.a-c）以及CRISPR/Cas9引入的SNORA31缺失的hESC來源的皮質神經元對HSV-1感染的敏感性也增加(圖5.d-e)。SNORA31突變的神經元對HSV-1感染和免疫刺激劑的免疫響應水平又如何變化：轉錄組分析顯示SNORA31突變的神經元對TLR3和IFN-α/β刺激的免疫響應正常(圖6.a-c)，而對HSV-1感染引起的免疫響應受損(圖6.d-e)。

圖6

總而言之，Shen-Ying Zhang和Jean-Laurent Casanova等人的研究顯示，人SNORA31基因變異削弱了大腦皮層神經元對單純皰疹病毒1（HSV-1）的固有免疫力，並為單純皰疹病毒性腦炎發生提供了基礎。非常棒的一個研究，將非編碼RNA推上臨床重要的一篇重磅研究。然而，此篇研究並未涉及SNORA31調控抗病毒免疫的分子機理，因此關於SNORA31影響抗病毒固有免疫的分子機理仍是個謎。
https://www.nature.com/articles/s41591-019-0672-31.   S. Y. Zhang et al., TLR3 deficiency in patients with herpes simplex encephalitis. Science 317, 1522-1527 (2007).

2.    S.-Y. Zhang et al., Inborn Errors of RNA Lariat Metabolism in Humans with Brainstem Viral Infection. Cell 172, 952-965.e918 (2018).

3. A. Kiss, B. Jády, E. Bertrand, T. Kiss, Human box H/ACA pseudouridylation guide RNA machinery. Molecular and cellular biology 24, 5797-5807 (2004).