速遞丨靶向YAP介導的T細胞抑制或將改善BRAF突變型黑色素瘤患者預後

速遞丨靶向YAP介導的T細胞抑制或將改善BRAF突變型黑色素瘤患者預後

2018-03-23 來源：醫脈通

導讀：Hippo-YAP信號通路是腫瘤抑制的一個重要信號通路。新證據表明，YAP活化是黑素瘤BRAF抑制劑（BRAFi）的重要耐藥機制，YAP參與抑制抗腫瘤免疫應答。然而，YAP活性對CTL免疫應答的潛在直接影響仍是一個未知領域。

近年來，通過單抗阻斷免疫檢查點受體PD-1的治療方式使晚期黑色素瘤患者表現出了顯著的臨床反應。癌細胞表面PD-L1異常表達是許多腫瘤逃避抗腫瘤免疫應答的重要機制，PD-L1表達是免疫檢查點抑制劑有效反應的預測性生物標誌物。新研究表明，BRAFi耐藥性黑素瘤細胞以PD-L1依賴方式，通過激活YAP，逃避CD8+T細胞免疫應答。

研究方法

首先，獲取親本和BRAFi耐藥性SKMEL28和WM3248細胞。獲取A375SM細胞並在補充10% FBS的DMEM中培養。獲取MCF7，MDA-MB231和A172細胞並在補充10% FBS的DMEM中培養。獲取HT29，KM12和A549細胞，並在補充10％ FBS的RPMI1640中培養。獲取前，通過Sanger測序證實黑色素瘤細胞系BRAFV600E突變。連續處理2μMPLX4032兩個月，產生BRAFi耐藥性A375SM細胞。在含有2μMPLX4032的培養基中培養BRAFi耐藥性細胞系。Sanger測序證實耐藥細胞系具有BRAFV600E突變。常規檢測細胞系支原體感染。所有細胞系都儲存在液氮中，使用前培養不超過6個月。

應用逆轉錄病毒載體產生穩定表達YAP及其突變體的黑素瘤細胞和HEK293T細胞。製備克隆到pMSCV-puro載體中的FLAG-YAP野生型，FLAG-YAP-5SA和FLAG-YAP-5SA-S94A cDNA，進行逆轉錄病毒顆粒裝配，轉染和嘌呤黴素選擇。根據製造商說明，應用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）獲得的siRNA轉染細胞。

主要結果

1.YAP激活可誘導BRAFi耐藥性黑素瘤細胞上PD-L1表達

為研究YAP激活對免疫檢查點通路的影響，研究人員首先檢查了表達組成型活性YAP的黑色素瘤細胞的T細胞共抑制/共刺激配體（PD-L2，B7-1，B7-2，半乳糖凝集素9和CD155）。研究人員建立了具有FLAG標記的YAP-5SA載體的BRAFV600E突變型黑素瘤細胞系（SKMEL28, WM3248和A375SM）。既往研究表明，通過Hippo通路激酶LATS1和LATS2阻止YAP抑制性磷酸化，5SA突變會引起YAP組成型核定位和轉錄激活。注意，相較於親代細胞，表達YAP-5SA的黑色素瘤細胞系表現出更廣泛的PD-L1和PD-L2表面表達。另外，YAP-5SA（而非野生型YAP）過表達增加了三種黑色素瘤細胞系中PD-L1 mRNA表達以及其表面蛋白質表達。這些結果表明，YAP激活誘導了黑素瘤細胞中的PD-L1表達。研究人員還觀察到乳腺癌（MCF7，MDA-MB231），NSCLC（A549），結腸癌（HT29）和成膠質細胞瘤（A172）細胞中YAP-5SA誘導的PD-L1上調。然而，YAP-5SA表達並未顯著增加KM12結腸癌細胞中的PD-L1水平，這表明YAP介導的PD-L1誘導依賴於細胞背景。

研究人員還檢測了BRAFi（威羅菲尼）耐藥性黑色素瘤細胞中的PD-L1 mRNA和蛋白質表達。相較於親本細胞，BRAFi耐藥性SKMEL28, WM3248和A375SM細胞更多地表達PD-L1 mRNA和細胞表面蛋白。RNAi介導的YAP及其旁系同源TAZ敲低抑制了BRAFi耐藥性細胞中的PD-L1轉錄和細胞表面表達，這表明YAP/TAZ活性增強與PD-L1表達增加相關。微陣列數據（GSE68599）比較了親本和BRAFi耐藥性黑素瘤細胞以及YAP/TAZ耗竭的耐藥細胞，結果證實免疫檢查點配體中耐藥細胞PD-L1上調以及YAP/TAZ敲低後PD-L1表達減少。總之，這些結果表明YAP活化上調了黑素瘤細胞上的PD-L1表達。

2.YAP上調PD-L1，但獨立於EGFR, AKT, MAPK和IFNγ通路

我們知道，EGFR，AKT和MAPK致癌通路激活可以誘導癌細胞上PD-L1表達。為檢測這些通路是否參與YAP介導的PD-L1表達，研究人員應用埃羅替尼（EGFR抑制劑），MK-2206（AKT抑制劑）或PD0325901（MEK抑制劑）處理表達YAP-5SA的黑素瘤細胞並檢測PD-L1表達。結果表明，很大程度上，PD-L1表達升高不受抑制致癌信號傳導通路的影響，這說明YAP介導的PD-L1表達不需要這些通路。在延長的T細胞免疫應答期間，IFN-γ暴露也誘導PD-L1表達，引發適應性免疫逃避，因此研究人員檢測了YAP是否參與IFNγ介導的PD-L1上調。短期（48小時）和長期（7天）IFNγ處理不能促進YAP核定位。此外，YAP/TAZ消耗不影響IFNγ誘導的PD-L1。研究人員還檢測了YAP激活對JAK / STAT通路（IFNγ信號傳導的主要下遊效應子）的影響。表達模擬物和表達YAP-5SA的黑素瘤細胞中均無磷酸化STAT1活性，但IFNγ處理的模擬A375SM細胞顯示出高磷酸化STAT1。這些結果說明IFNγ通路和YAP獨立調節PD-L1表達。

3.YAP與PD-L1增強子區域結合併促進PD-L1轉錄

YAP主要通過與TEAD家族轉錄因子相互作用來促進靶基因轉錄。在TEAD結合位點引入突變可以顯著抑制PD-L1上調。此外，應用維替泊芬處理YAP-5SA表達細胞可減少PD-L1 mRNA和表面表達。因此，完整的YAP-TEAD相互作用是上調PD-L1轉錄（通過YAP活性）的必要因素。其次，研究人員通過回顧公開可用的ChIP-seq數據，在潛在的PD-L1基因增強子區域探究了YAP-TEAD結合位點。他們在PD-L1轉錄起始位點的13-kb上遊發現了可能提供YAP-TEAD結合位點的一個TEAD4結合窄峰。為確認YAP與這個區域結合，研究人員進行了ChIP分析。他們檢測到了YAP-5SA與13kb上遊區域特異性結合活性。為驗證通過該候選增強子區域，YAP驅動的PD-L1轉錄激活，研究人員將13kb上遊序列（800bp片段）克隆到具有最小啟動子的螢光素酶載體中。增強子序列驅動的螢光素酶活性在表達YAP-5SA的HEK293T細胞中顯著高於模擬轉染的HEK293T細胞。這些結果表明，與13kb上遊增強子結合的YAP-TEAD直接誘導PD-L1轉錄。

4.BRAFi耐藥性黑素瘤細胞逃避腫瘤抗原特異性CD8+T細胞免疫應答

YAP激活促進BRAFi耐藥性和PD-L1表達，YAP是BRAFi耐藥性和免疫逃逸過程之間的分子橋梁。因此，研究人員研究了BRAFi耐藥性黑素瘤細胞中YAP活化對腫瘤抗原特異性CD8+T細胞效應子功能的影響，應用表達HLA-A2的A375SM細胞進行細胞毒性測定。YAP-5SA表達和BRAFi耐藥性均不影響HLA-A2表達。研究人員建立了HLA-A2限制性Melan-A肽特異性CD8+T細胞系（來自HLA-A2+健康供體的外周血單核細胞）。所得的細胞培養物含有95.9％的Melan-A26-35特異性CD8+T細胞並表現出最低程度的PD-1表達。為模擬腫瘤微環境中的T細胞耗盡，研究人員應用攜帶YAP-5SA的Melan-A26-35肽脈衝PD-L1+A375SM黑素瘤細胞培養T細胞系。培養7天後，研究人員觀察到T細胞上PD-1表達的強烈誘導。然後，他們檢查了PD-1+Melan-A26-35特異性CD8+T細胞抗同源抗原脈衝親本和BRAFi耐藥性A375SM細胞的細胞毒性。CD8+T細胞成功殺死了親代A375SM細胞，隨著效應子/靶標比率的增加，細胞毒性成比例增加。BRAFi耐藥性A375SM細胞表現出對CD8+T細胞細胞毒性的抵抗性，它可以通過阻斷PD-1而恢復，但抗PD-1抗體不影響親代細胞的殺傷力。他們還研究了與黑素瘤細胞共培養的T細胞的其他效應器功能。結果表明，與BRAFi耐藥性黑素瘤細胞共培養的CD8+T細胞中，IFNγ，TNFα產生顯著減少，CD107a表達顯著降低。這證實了BRAFi耐藥性黑素瘤細胞中T細胞耗竭。與細胞毒性恢復一致，抗PD-1抗體治療恢復了T細胞效應功能。這些結果表明，BRAFi耐藥性黑素瘤細胞通過PD-1依賴性CD8+T細胞耗竭誘導免疫逃逸。

5.YAP介導黑素瘤細胞中腫瘤抗原特異性CD8+T細胞免疫逃逸

研究人員通過測定抗模擬和表達YAP-5SA的A375SM細胞的細胞毒性，研究了YAP激活對PD-1+Melan-A26-35特異性CD8+T細胞免疫應答的影響。表達YAP-5SA的黑色素瘤細胞比模擬細胞更具耐藥性，PD-1阻斷逆轉了表達YAP-5SA的A375SM細胞的T細胞細胞毒性。Melan-A26-35特異性CD8+T細胞與YAP-5SA-表達細胞共培養減少了IFNγ和TNFα的產生，使CD107a表達減少。PD-1阻斷可以恢復IFNγ，TNFα和CD107a表達減少。因為YAP-5SA誘導PD-L2和PD-L1表達，研究人員探究了PD-L1和PD-L2是否有助於YAP介導的T細胞抑制。與抗PD-1類似，PD-L1阻斷抗體恢復了T細胞的細胞毒性功能，IFNγ和TNFα產生以及CD107a表達。相反，PD-L2阻斷抗體治療並不影響CD8+T細胞抗YAP-5SA表達黑素瘤細胞的細胞毒性和細胞因子產生，這說明PD-L2上調不是YAP介導的T細胞抑制的必要條件。總之，這些結果表明，黑素瘤細胞中YAP活化可以促進細胞毒性T細胞PD-1/PD-L1依賴性逃避。

PD-1阻斷使與表達YAP-5SA的黑素瘤細胞共培養的CD8+T細胞的細胞毒性功能不完全修復。一種可能是PD- /PD-L1相互作用可能不會被抗PD-1完全阻斷；另一種可能是YAP可能引起獨立於PD-L1的免疫逃避機制。與YAP-5SA-表達黑素瘤細胞共培養後，非耗竭PD-1陰性Melan-A26-35特異性CD8+T細胞的細胞毒性功能和細胞因子產生受抑制，該抑制不受PD-1阻斷的影響。這表明，YAP可以以PD-L1依賴性和PD-L1獨立的方式，促進黑色素瘤細胞的免疫逃避。

6.YAP激活與黑素瘤組織中更高的PD-L1表達相關

為驗證YAP介導的PD-L1表達的臨床意義，研究人員探究了人類黑素瘤腫瘤樣品中YAP活性與PD-L1表達之間的關係。首先，他們分析了來自TCGA資料庫的472個黑素瘤腫瘤的RNA-seq數據，根據基因組變異分析（GSVA）計算的YAP信號富集分數對腫瘤進行分層。結果表明，具有高YAP富集評分的腫瘤具有顯著更高的PD-L1表達。另外，他們對來自65名黑素瘤患者腫瘤標本的YAP和PD-L1進行了免疫組織化學染色。如預期，相較於細胞質YAP染色（低YAP活性）的腫瘤，核或核漿YAP染色（高YAP活性）的腫瘤具有顯著更高的PD-L1表達。他們還探討了BRAFi耐藥性黑素瘤既往發布數據中YAP和PD-L1之間的聯繫。Hugo等人全面分析了BRAFi / MEKi療法（GSE65185）前後收集的配對黑素瘤樣品。他們在某些耐藥腫瘤中發現了YAP信號激活。PD-L1表達與預處理腫瘤中的IFNγ表達相關。然而，在獲得耐藥性後，這種相關性減弱，這表明IFNγ以外的因子在控制BRAFi / MEKi耐藥性腫瘤中PD-L1表達中起關鍵作用。YAP信號富集的BRAFi / MEKi耐藥性腫瘤亞組中PD-L1也高度上調。總之，這些數據提供了人黑素瘤腫瘤中YAP介導的PD-L1上調的體內證據。

文章編譯自：Min Hwan Kim1, Chang Gon Kim1, Sang-Kyum Kim2, Sang Joon Shin, Eun Ah Choe, Su-Hyung Park1, Eui-Cheol Shin1, Joon Kim1.YAP-induced PD-L1 expression drives immune evasion in BRAFi resistant melanoma. Cancer Immunology Research. January 30, 2018.

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