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寫在前面非常感謝韋老師和凌恩公司舉辦的多次微生物領域的講座，雖然之前的一段時間我沒足夠的時間聽直播，幸好有回放，因為這裡面的東西實在都是我們都在思考和目前的一些熱點。這次第五期我周末抽了一點時間看完，已經有很大的幫助了，雖然一些問題並不能有一個好的解釋，但是我們最起不在彷徨，大佬都不糾結，我們也不用怎麼過度思考。
問題總結擴增子研究中批次效應太大，儘量不要多次測樣
擴增子分析儘量使用ASV來聚類OTU，認可比較大，比較主流
系統發育在組間比較還是要注意，鄧老師作為開發者目前也只是在組內比較。
建議做系統發育分析要比對方法之間的適應性，而不是簡單的借用，參考使用。
稀有物種是否可靠是作為是否用其來參與系統發育分析的一個評價指標。
核心物種很熱，但是沒有標準，用問題來評估，或者制定標準。
問題第一個問題：菌群構建：有時候用零模型，有時候用中性理論？理解看到的群落，通過方法打亂群落，選擇方法很重要，評估選擇的方法，但往往跟著別人走。目前呢主要有零模型，中性理論，還有那個打亂進化樹的那個方法。背後機理，假設不同，最終選擇哪種方法，建立進行一系列條件的比較。使用比較的方法，不要僅僅看比率，要比較，看不同群落之間過程的差異。
第二個問題 ：核心微生物的定義是？劃分是局限的，但是很重要。微生物量很重要，做研究的話，劃分標準，要根據研究範圍和科學問題調整：
所以與科學問題有關係，目前沒有標準。只有問題。
自己構建分析系統，有什麼建議？擴增子測序平臺：看你的目標是什麼？只是做一個擴增子標準分析，沒有必要做這樣一個分析平臺。鄧老師和別人合作比較多，希望把平臺規範化，所以構建了平臺，這是目標。最麻煩的選用什麼工具，評估工具，規範最好。目前每個人不一樣
基本上就是買一臺伺服器，鄧老師使用的平臺已經有框架了，自己構建的功能並構建到平臺上。
群落裝配，零模型計算bNTI的數據過濾問題？組裝研究過程中，發展非常快，方法不斷跟新，領域只是個初級階段，不夠穩定，可能會得到不同結果，不同設置：數據過濾，不同比例的應用。
最簡單的評價規則：數據過濾的判斷通常來講，理解數據中的稀有物種，認為這部分是否可靠。實際上其他分析裡面，一開始就直接去掉了，asv默認序列提取就大於10個序列以上（這是usearch），所以OTU的表是否可靠，不要保留過多的稀有物種。
第一個bNTI這個方法基於樹的打亂。和序列的可靠程度有密切關係。所以可靠的OTU數據。第二個，我們認為比率上並不是一個絕對的量，組內的和組間的不同，我通常選擇組內的進行比較，建議謹慎，組裝過程往往使一個點，傳遞的信息往往具有承接性，用多種方法同時功鞏固同一個結果。
二分網絡：跨界互作，細菌和古菌關係？等和其他等都會有類似的應用？從原理上來講都是可以使用的，使用規範上和解釋程度上，我門開發的都是一種推測的相關，還需要驗證是否存在這種情況。
網絡只是個方法，生物學解釋和結論需要用生物學證據來證明。
宏基因組樣本組裝？依據是什麼？config的使用宏基因組發展很快，組裝工具的使用，內部參數使用，通常來說速度和準確性的平衡，宏基因組分析裡面還要看完整度，選用方法得到的contig，感覺不太好想改變，想相對完整組裝好一些。
我們知道環境微生物，近源非常多，所以得到的不是一種菌的contig？沒有對和錯，因為本來就不知道。希望得到比較長的contig，進一步分析，但是出現錯誤的情況，可能性會逐漸增多。確實要小心，這些不是一個種，是好幾個種的混合。不同的人，都會用自己的方法。這個領域發展很快，數據的應用是一個巨大的挑戰。
全長的問題-16s全長？鄧老師認為這是一個趨勢，喲比較大的好處，信息部較多，比較完整，個人認為是挺重要的，但是經費？所以應用起來不是很多，權衡的過程。
16s測序僅僅提供的最基本的群落變化的依據，深入往下做的，那還需要做全長嗎？現在微生物群落測定成本依據很低了，已經常態化的一個指標，只能得到一個基本的信息。
鄧老師認為這是一個很重要的方向。三代測序成本會高一些，但是會之間下降。
網絡分析群落互作功能關聯?抗性基因和氮循環資料庫鄧老師做了，那有沒有考慮其他資料庫？
都在向功能來聚焦，想著方向發展，鄧老師認為這是發展方向，做完16s之後會逐漸往這個方向發展，只有功能才會是生態方向的變化，這個才能弄清楚生態的功能變化。是一個方向，一個重點。
但，抗性基因，等其他功能，為什麼我們關注這方面呢個？這些方面研究的基礎會多一些，碳，微生物是分解者，為什麼？因為降解碳，還給生態系統。微生物碳非常重要，降解是關注點，但是太複雜，每一個微生物都在承載碳循環的過程，但是碳源的利用會有傾向性，基因組上和碳循環相關的基因非常多，降解的完全不一樣，鄧老師在做一些嘗試，但是太複雜，選擇功能基因會很困難。
因此做一些目標性的基因，甲烷降解等，鄧老師也在做一些工作。
OTU和asvASV有幾個主要的方法，OTU給定閾值，在感念上不同
單一鹼基不同就不同，97%會有一些一樣
ASV方法在去除不可靠序列會有自己的標準，好像和OTU的方法不同，有的時候差距十倍？
有時候卻差不多？
等
如何選用？
常用的ASV方法，因為常用，OTU不足，實際上得到的結果不足，ASV在普遍上的接受程度非常高。
OTU的好處是允許少量鹼基的變化，這種誤差可以消除，但是ASV來做的話無法去除這種影響，因此，在擴增上如果使用ASV的話儘量使用高保真酶。
測序批次的問題？去除批次差異，回歸樣本或則分組之間的差異比較；
說實話鄧老師以前也關注這些問題，不同實驗室，測序平臺，往往不同，影響很大，也可以比較，用的方法也沒有一個合理可靠的方法，通常來講，我們要比較差別在哪裡，首先去除稀有物種，序列數量比較少的去除。但是也不一定，和測序平臺等有關係。
好一點就是儘量一次測定。
或者重新在測定一次。當然尤其是高豐度的微生物是可以整合在一起的。
反應器 群落簡單？反而好做做反應器的生態學的東西？是否會容易？
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