近日，美國生物化學學會會刊（The Journal of Biological Chemistry, JBC）在線發表了中國農業大學動物醫學院夏春課題組李曉迎博士等最新研究成果：雞MHC-I擇優遞呈高致病性禽流感 H5N1病毒(HPAIV)T細胞表位的結構學機制（Structures of the MHC-I molecule BF2*1501 disclose the preferred presentation of an H5N1 virus-derived epitope）。本文首先對已知的HPAIV主要毒株全病毒進行了掃描，並通過系列實驗預選了其T細胞表位（CTL表位）；隨後，採用多肽免疫以及三維（3D）結構解析，詳細闡述了HPAI H5N1一條高度保守的CTL表位，以及此表位被雞pMHC-I擇優呈遞的結構學機制。
高致病性禽流感H5N1病毒的流行不僅對養禽業造成嚴重經濟損失，而且對人類健康產生威脅。迄今為止，主要採用滅活疫苗防控禽流感。然而，由於禽流感病毒具有高度變異性的特點，滅活苗往往對變異毒株不能產生較好的免疫保護。與抗體免疫不同，由CD8+ T細胞介導的表位特異性免疫應答能夠識別相對保守的CTL表位，對保有此表位的不同毒株以及變異株也可產生免疫保護。然而，目前尚無確切的禽流感病毒T細胞表位鑑定與應用相關報導，阻礙了基於T細胞免疫應答的表位疫苗開發，延緩了對雞以及禽流感病毒特異性CD8+ T細胞免疫反應應答的深入研究。為此，本文以高致病性禽流感H5N1CTL表位為研究目標，通過系統篩選來源於不同毒株全蛋白的病毒多肽，從CD8+ T細胞識別與免疫應答水平鑑定出了具有高度保守性的T細胞表位PA123-130（圖1）。
圖1. PA123-130表位免疫後雞的特異性CD8+ T細胞的檢測
註：(A) 雞的免疫程序及外周血淋巴細胞分離和檢測示意圖。(B) 流式細胞檢測PA123-130表位特異性CD8+ T細胞。(C) PA123-130表位特異性CD8+ T細胞在多肽免疫組、滅活苗免疫組和空白對照組之間差異顯著性分析
通過與其它源於禽流感病毒蛋白的多肽免疫和檢測數據對比分析發現，PA123-130被B15品系雞MHC-I分子BF2*1501擇優遞呈。為明確其分子結構機制，本文進一步解析了BF2*1501-PA123-130複合體的三維結構(pBF2*1501-PA123-130)，並分析發現， pBF2*1501-PA123-130的多肽結合槽（PBG）口袋（C，D，E）空間大小或介於已知的BF2*2101和BF2*0401相應口袋大小之間（圖2）。
圖2. BF2*1501多肽結合槽口袋（藍色）與BF2*0401（黃色）和BF2*2101（粉色）相應口袋大小與胺基酸組成比較
分析發現，pBF2*1501-PA123-130中等大小的PBG是由組成相應口袋的胺基酸所決定。其中，胺基酸Arg68、Thr69和Gly152、Leu153分別與BF2*0401和BF2*2101相應位置胺基酸存在部分相似性，決定了BF2*1501具有中等大小的多肽結合槽以遞呈PA123-130表位多肽。pBF2*1501-PA123-130多肽結合槽B和F口袋為抗原多肽的錨定位點，相對較深且空間較大，趨向於結合具有長側鏈（B口袋）或具有芳香族側鏈（F口袋）的胺基酸（圖3）。進一步分析B口袋的帶電荷性質發現，B口袋顯示負電荷（圖3），說明B口袋對鹼性胺基酸如精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）具有選擇偏好性。
圖3. BF2*1501多肽結合槽具有較深的錨定口袋B和較大的錨定口袋F
註：（A）BF2*1501多肽結合槽錨定口袋B和F。（B）BF2*0401多肽結合槽錨定口袋。（C）BF2*2101多肽結合槽錨定口袋。組成口袋的胺基酸側鏈均已標註，且與表位多肽形成氫鍵作用力的胺基酸加粗顯示，氫鍵以黃色虛線標示。
除錨定口袋的限制性因素外，結合表位多肽N端胺基酸殘基的A口袋同樣影響表位與MHC-I分子的結合與遞呈。首先，通過分析多肽與BF2*1501 PBG之間相互作用力（包括氫鍵、鹽橋和範德華力）發現，抗原表位PA123-130 N端胺基酸殘基Arg-1與A口袋之間的相互作用力僅次於Arg-2和Tyr-8與B口袋和F口袋的相互作用力，說明Arg-1與A口袋的結合對穩定的BF2*1501-PA123-130複合體的形成起重要作用。其次，Arg-1與BF2*1501 A口袋內的Glu62通過3個鹽橋互作，與Tyr58通過一個氫鍵互作（圖4），而這些相互作用力在已報導的其它雞pBF2複合體中未被發現。最後，BF2*1501 A口袋呈現帶負電荷的化學性質，決定了其更易結合鹼性胺基酸，而排斥酸性胺基酸。這一點在多肽-BF2*1501複合體的體外復性實驗中也進一步得到了證實。在篩選的一系列抗原多肽中，來源於禽流感H5N1病毒M2蛋白的多肽M243-51，其N端為酸性胺基酸天冬氨酸（Asp-1），該多肽則不能與BF2*1501形成穩定的複合體（圖4）。
圖4. BF2*1501多肽結合槽中A口袋與Arg-1的結合
註：（A）分析BF2*1501 A口袋與Arg-1的相互作用。（B）分析BF2*2101 A口袋與Arg-1的相互作用。（C）BF2*1501 A口袋呈現帶負電荷的化學性質。（D）來源於H5N1的抗原多肽與BF2*1501體外復性效果檢測。
儘管多肽與BF2*1501體外復性實驗結果顯示，大部分來源於H5N1的多肽均能與BF2*1501形成穩定的複合體，然而，多肽免疫雞的結果進一步顯示了PA123-130可被擇優識別；並進一步推斷BF2*1501-PA123-130具有能夠被特異性TCR識別的結構特點。
本文進一步解析了BF2*1501結合自身肽CBP22-29的三維結構。對比兩者的結構發現，PA123-130表位肽中胺基酸Tyr-7的長側鏈突出於BF2*1501的多肽結合槽外，成為被TCR識別的一個關鍵點；而自身肽CBP22-29則不具備這一特徵（圖5）。
圖5. BF2*1501遞呈PA123-130和CBP22-29的結構比較
註：與CBP22-29相比，PA123-130具有突出於PBG的胺基酸Tyr-7（左側）。通過與模擬分析，PA123-130中的Tyr-7可作為被特異性TCR識別的熱點（右側）。
綜上所述，本文通過解析雞BF2*1501-PA123-130複合體的精細結構，闡明了一T細胞表位可被擇優遞呈的分子機制。BF2*1501多肽結合槽中A、B和F口袋的胺基酸組成和化學性質決定PA123-130能夠被穩定結合和遞呈，而PA123-130的胺基酸結構特徵則決定了是否可被CD8+ T細胞特異性識別。闡明雞MHC-I分子擇優遞呈T細胞表位的結構學機制，為推進雞的CTL免疫應答以及新型疫苗的研發提供了結構學平臺與具體數據。
本期編輯：左腦