40分+文獻解讀|巧用被忽視的「體細胞突變」數據發Science

我們一直主張「醫生發臨床SCI論文其實很簡單」,「好醫生因為觀察仔細而更容易做出高質量的臨床科研」。本次我們以Science雜誌(IF 41.845)的一篇論文為例分享，教你如何「臨床與基礎結合，發表高質量SCI論文」。該論文的題目是「Macroscopic somatic clonal expansion in morphologically normal human urothelium」（形態正常的人尿路上皮的宏觀體細胞克隆擴增），發表於2020。由北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）白凡課題組與北京大學人民醫院泌尿外科徐濤課題組合作完成。在這項研究中，作者結合使用雷射捕獲顯微切割技術（laser-capture microdissection）和外顯子組測序，系統地研究了120例尿路上皮細胞癌（urothelial cell carcinoma, UCC）患者的包括膀胱尿道和輸尿管尿道上皮在內的形態正常尿道上皮（morphologically normal urothelium, MNU）的體細胞突變體克隆事件。我們一起學習，作者是怎麼做到的。

 

一，研究背景（立項依據）

整個生命周期中，不可避免地會發生體細胞突變，這主要是由於細胞分裂過程中發生的DNA未修復或錯誤修復引起的。儘管正常細胞中的大多數體細胞突變沒有任何表型後果，但影響必需基因（尤其是那些與細胞增殖和死亡相關的基因）的突變可能會觸發突變體克隆擴增，一個廣為熟知的例子即為「癌症」，其中體細胞突變的逐步積累驅動了克隆的擴增和細胞的最終惡性轉化。

但是目前，對惡性轉化之前正常細胞中體細胞突變的模式和驅動因素了解甚少。

尿道上皮被歸類為過渡上皮，具有很高的再生能力，可以應對損傷從而確保其屏障功能。由於尿路上皮直接與尿液接觸，因此尿路上皮持續暴露於一系列潛在的致癌代謝產物和環境因素中，這些代謝產物和環境因素可能導致組織損傷並對尿道上皮細胞造成遺傳毒性。在這些條件下，尿路上皮可能通過反覆的細胞更新積累體細胞突變。

本文章中多涉及生物信息分析方法，臨床醫生簡單作為了解即可。我們重點從臨床醫生角度看，自己如何設計和完成類似研究。

首先，作者總共對120例行根治性膀胱切除術或腎結直腸切除術的UCC患者的161個MNU樣本（來自膀胱的125個和來自輸尿管的36個）進行了測序。經病理學檢測，這些從遠離腫瘤部位提取的MNU樣品沒有組織學改變。

此外，對120例患者中的126例腫瘤（93例膀胱癌，17例輸尿管癌和16例腎盂腫瘤）組織也完成測序，並對上述測序結果進行分析（具體分析過程不在此贅述）。

在對測序結果進行分析之後，作者為了探索潛在的誘變驅動因素，對MNU和UCC樣本使用了非負矩陣分解算法，以提取潛在的突變特徵。

作者發現潛在病因是一種臭名昭著的誘變劑，馬兜鈴酸（aristolochic acid, AA），AA誘變在正常人體組織中非常普遍，且在女性中更為常見。雖然在上尿路尿路上皮癌中有這種性別偏見的報導，但潛在的機制尚不清楚。這篇文章的發現表明，AA暴露會對尿路上皮細胞產生強烈的遺傳毒性，並廣泛觸發正常尿道上皮的誘變。

隨後，作者使用外顯子組測序數據評估了MNU和UCC樣品中的拷貝數變化（copy number alterations, CNA），觀察到腫瘤與MNU之間CNA的顯著差異。如TCGA資料庫一致，腫瘤在整個基因組中存在大量CNA。然而，CNA在MNU樣本的基因組中很少見。

作者進一步探討UCC和MNU組織中體細胞突變和CNA的積累如何協調。值得注意的是，作者發現其中一些MNU組織，特別是暴露於AA的MNU組織，其突變負擔與腫瘤的相似或甚至更高，但其絕大多數基因組仍為二倍體。這一發現暗示CNA的獲得發生在尿路上皮的克隆擴增的後期，並且基因組穩定性是最終惡性轉化的瓶頸。

接下來，作者發現AA相關和非AA相關的MNU突變負擔明顯不同，與AA相關的MNU的突變負擔範圍很廣，中位數（每Mb 2.2個突變）高於乳腺癌（每Mb 0.9個突變）和腎透明細胞癌（每Mb 1.5個突變），相反，非AA相關的MNU的突變負擔比AA相關的MNU的突變負擔低一個數量級。

此外，作者發現AA暴露還可以大大加速體細胞突變的積累並增強正常尿道上皮細胞的克隆擴增。

圖3. 突變負擔和突變克隆體擴張

隨後，作者對來自患者（P4）輸尿管的兩個腫瘤和三個MNU樣品進行了測序。這五個樣本所攜帶的體細胞突變彼此不同，表明它們是獨立進化的，且所有五個樣品均顯示出清晰的AA相關突變特徵。

給定不同的採樣點，作者的結論AA觸發的突變過程可以擴散到整個輸尿管，且在其他患者中也觀察到了類似結果。

6，MNU中的單個與馬兜鈴酸相關的克隆可以擴張到幾平方釐米的大小

前面的結果已經證明，AA誘變驅動MNU中的突變體克隆擴展。然而，與AA相關的突變體克隆可以擴展到多大規模尚待闡明。

作者對來自患者（P7）的六個MNU樣品進行了測序，這些樣品是從膀胱中不同部位提取的，突變負擔範圍為每Mb 1.7至7.6個突變。最後，作者使用Dirichlet流程將體細胞突變聚類為突變體克隆，通過分析再加上採樣距離，結果表明，一個與AA相關的突變體克隆可以大規模擴展到幾平方釐米的大小，在另一個患者樣本中觀察到了相似的結果。

這項研究中，我們需要關注的是對於合作臨床醫生的要求：

這個要求知識積累，多閱讀領域相關文獻，了解研究進展，抓住問題要害。基於這些，可以尋求與高校，研究所及公司合作，能利用技術手段解決的問題都不是問題。

本文結果總共分為六個部分，但是在邏輯上是層層遞進的關係，包括從臨床取樣，病理檢測到測序比對，系統發生樹的重構等；當然，這些也都可以與高校基礎學科的課題組合作完成，「術業有專攻」，他們除了有先進的技術手段外，在解決問題的思路上與臨床大夫也可互相借鑑。

很多疾病的發生發展都與所處的環境密切相關。以這篇文章為例，AA誘導突變，AA在亞洲傳統草藥中很普遍，因此本研究的結果可能反映了中國和亞洲人群的特異性；比如我國食管癌就有特定的高發省市，是否也有當地人民的飲食習慣相關？臨床醫生也可以結合流行病學的數據來推進課題。

這是最最關鍵的。樣本庫並不是只是標本，而是需要有完整的臨床資料，尤其是明確診斷和規範治療，並有隨訪結果；並且，要根據設計在疾病的不同病程留取樣本。這樣的樣本庫才能做成頂級研究。

所以這篇論文不僅僅是一篇非常好的臨床-基礎研究結合的論文，也是一個很好的研究生課題，以及一些小的基金設計，如首特基金、或者博士後基金等。（1）這項研究使用相對較大的樣本量和適度的測序深度觀察了MNU中可變數量的體細胞突變；（2）突變特徵分析揭示了MNU中潛在的AA誘變現象，表明AA觸發的突變過程可以在體內正常人體細胞中廣泛發生。特別注意。AA在亞洲傳統草藥中很普遍，因此本研究的結果可能反映了中國和亞洲人群的特異性。（3）出乎意料的是，在這項研究中作者發現單個AA相關克隆可以急劇擴展到幾平方釐米的大小。但是，要確定尿路上皮中AA致突變和AA觸發的克隆擴增的精確大小，需要使用更密集的採樣方法進行進一步研究。（4）這項研究具有潛在的臨床意義，對於AA相關的UCC患者，更激進的治療策略可能更合適，因為他們看似正常的尿路上皮可能具有較高的突變負擔，並經歷了突變的克隆擴增，且這樣的狀況可能實質上導致腫瘤復發。近些年來，包括生物學，物理化學，臨床醫學等學科交叉的現象越來越火熱，臨床擁有龐大的樣本庫，而基礎學科現在已發展出或正在發展出各種最先進的技術手段以解決當前大量懸而未解的科學難題，臨床與基礎學科的結合可以高效而精確地解答人類許多疑難雜症的發病機制，並為臨床診斷和幹預治療提供機會。這篇文章是由北大BIOPIC白凡課題組和北大人民醫院泌尿外科的徐濤課題組合作測序研究體細胞突變，並且發表在國際著名期刊Science雜誌。與此類似，北大生命科學學院湯富酬團隊也已經與北醫三院的喬傑團隊及付衛團隊密切合作，在Science，Cell，Cell Stem Cell等國際著名期刊發表多篇文章，利用單細胞測序技術闡明人類胚胎發育機制及人類結直腸癌的轉移機制等。多學科交叉合作已然是一種趨勢，因此，許多臨床醫生都可以利用自身的醫療資源優勢，與高校課題組建立合作關係，最終達到互利共贏的結果。

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