在 3D 細胞培養大行其道的今天，基底膜提取物（BME）作為維持細胞穩定生長和健康狀態的支架，其重要性不言而喻。計劃開展實驗時，問題也接踵而來：
BME 的基本成分是什麼？
BME 包被細胞的方法有哪些？
不同的細胞培養應選擇什麼包被方法？
操作時有哪些注意事項……
什麼是基底膜提取物
基底膜提取物（BME），又稱為基底膜基質或基底膜基質膠，是一種商業上銷售的、包含有細胞外基質（ECM）的基質膠，其中包含膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖等成分。
BME 是從 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤組織中純化而來的，為細胞粘附和細胞結構提供了底物，還可以為細胞間相互作用提供優化的環境，促進類似體內的 2D 和 3D 生長動態。同時，也可以通過更多的純化步驟來生成低生長因子（RGF）版本的 BME，適合限定培養條件的應用，如多能幹細胞的擴增和分化或類器官的培養。
細胞培養中細胞外基質的關鍵特徵
由於 BME 有著獨特的物理特性：在 2~8 °C 時呈現液態，而在室溫或 37 ℃ 時迅速固化，液態的 BME 可以輕鬆操作和稀釋，但是 2~8 °C 以上的溫度波動或短暫暴露都會影響 BME 的物理性質，因此最佳做法是始終保持低溫或置於冰上。以 Bio-Techne 的 CultrexBME 為例，在處理時，應注意：
將所有儲液放置在 -80 °C 長期保存（1 個月以上）；
將冷凍的 Cultrex BME 置於 2~8 °C 的冰箱內，在冰上過夜解凍，這樣可以充分融化，同時讓產品保持在穩定的低溫環境；
按每次使用量分裝，將分裝產品放置在 -80 °C 長期保存；
將所有儲液放置在 -80 °C 長期保存（1 個月以上）；
切勿在 2~8 °C 保存 CultrexBME 超過一天；
如果溫度超過 18 °C，CultrexBME 將會變成凝膠，因此必須始終置於冰上，並使用預冷的耗材和工具（如移液吸頭），且動作要快；
始終使用預冷的細胞培養基稀釋 CultrexBME。
選擇合適的 BME 包被方法
BME 可用於多種細胞培養，而各種包被方法應該如何選擇，取決於起始材料的類型（單個細胞或組織）、您感興趣的細胞或組織的粘附要求，以及 2D 或 3D 培養體系的需求等。
例如，胚胎或誘導多能幹細胞（ES/iPSC）的擴增或分化可採用不同方法包被。CultrexBME 的薄層包被提供了基本底物，可以支持無滋養層的多能幹細胞擴增。而在將幹細胞分化成終末細胞類型時，有時會採用夾心包被法，也就是將細胞嵌在兩層 BME 之間。
對於需要額外粘附支持的培養物（比如 iPSC 來源的可收縮的心肌細胞），這種方法特別理想。其他方法，如厚層包被、包埋和圓頂包埋方法，常用於更複雜的 3D 培養系統（表 1）。
表 1. CultrexBME 包被方法說明
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薄層包被法
CultrexBME 的薄層包被法為細胞增殖和維持提供了附著的 ECM 底物。它通常用於胚胎幹細胞和誘導多能幹細胞的擴增，也廣泛應用於細胞系或原代細胞。
簡單地說，這種方法是用預冷的細胞培養基來稀釋預冷的 Cultrex BME，將溶液移液至培養皿中，然後在 37 °C 下孵育至少 30 分鐘來固化基質。懸浮在培養基中的細胞被接種到各孔中，之後它們附著在薄層包被的 CultrexBME 上。這種包被方法的優勢是操作簡單，適用於下遊的免疫細胞化學和細胞成像應用。
薄層包被快速操作
利用薄層包被法培養誘導多能幹細胞。圖像顯示了利用 Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME（貨號 3433-005-01）培養的 iPSC 克隆。細胞經過 SOX1（紅色）、E-Cadherin（綠色）和 DAPI（藍色）染色。
厚層包被法
與薄層包被法相比，厚層包被法使用更高濃度的未稀釋 CultrexBME，能夠促進與體內更類似的細胞行為，特別適合 3D 結構的形成，比如血管生成研究中主動脈環和內皮細胞管腔形成。
這種方法直接將預冷的 CultrexBME 鋪在細胞培養容器中。將培養板置於 37 °C 孵育 30 分鐘，讓基質固化。懸浮在培養基中的細胞被接種到各孔中，之後它們附著在厚層包被的 CultrexBME 上。
厚層包被快速操作
利用厚層包被法形成內皮細胞管腔結構。收集人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）並計數，用內皮細胞基礎培養基（不含血清或血管生成因子）或內皮細胞生長培養基（含有支持 HUVEC 擴增的所有添加劑和生長因子）來稀釋細胞。將 HUVEC（1x104個細胞/孔）接種在凝膠狀的 CultrexRGF BME（貨號 3433-005-01）上，然後在 37°C 和 5% CO2中培養四小時。圖中呈現了在基礎培養基（左）和生長培養基（右）中培養的 Calcein AM（貨號 4892-010-01）染色細胞的代表性圖像。
夾心包被法
CultrexBME 的夾心包被法提供了一個更複雜的 ECM 微環境，讓細胞在更類似體內的 3D 環境中生長和分化。
在使用夾心包被法時，先用薄層包被法包被培養板。當細胞附著在培養板上之後，用另一層稀釋的 CultrexBME 覆蓋細胞。在這一層固化後，在各孔中加入培養基，培養細胞，直至出現所需的表型。儘管該過程比薄層包被法複雜，但細胞完全包埋在基質中，帶來了更剛性的 3D 支架環境。
夾心法包被快速操作
利用夾心包被法將多能幹細胞分化成心肌細胞。利用 StemXVivoCardiomyocyte Differen-tiation Kit（貨號 SC032B），採用夾心法將 JOY6（左圖）和 iBJ6（右圖）人誘導多能幹細胞分化成心肌細胞。除了肉眼觀察到可收縮的細胞，心肌細胞命運的決定可通過人心肌肌鈣蛋白 T（紅色）來評估。利用 DAPI（藍色，貨號 5748）對細胞核進行復染。
包埋法
在包埋法中，細胞被 CultrexBME 基質膠完全包圍，與其他包被方法相比，它在更類似體內的微環境中促進細胞擴增和成熟。包埋法的最常見應用包括：
球狀體的侵襲或侵襲實驗，可模擬腫瘤發生和腫瘤細胞轉移；
類器官或迷你器官的形成，如腸、腦、肝、腎和胰腺。
1、層次法
簡單地說，將預冷的 CultrexBME 與腫瘤細胞系、原代組織碎片或誘導多能幹細胞直接混合。將該混合物直接鋪在所需的細胞培養容器內。將培養板置於 37 °C 孵育 30 分鐘，讓基質固化。然後在固化的 Cultrex BME/細胞混合物的上面加入培養基。這種方法常用於類器官、球狀體的形成，以及細胞侵襲和遷移實驗。
層次包埋快速操作
包埋在 CultrexBME 的球狀體用於細胞侵襲和遷移實驗。在低吸附力的培養板上培養 MDA-MB-231（3,000 個細胞/孔）達 72 小時，形成球狀體。然後將球狀體包埋在 A) 無基質，B) 10 mg/mL Cultrex BME 或 C) 10 mg/mL Cultrex BME 和 1 mg/mL I 型膠原蛋白中。在基質膠固化後，向每孔中加入 DMEM、10% FBS，以促進 96 小時的趨化反應。請注意，CultrexBME 和 ECM 的選擇影響了細胞侵襲和遷移的程度。
2、圓頂法
將 CultrexBME 與類器官（1x104個類器官/mL 或 500 個類器官/50 μL）直接混合。將 50 μL CultrexBME/類器官混合物分配至 24 孔板的每孔中央（如圖），或在 6 孔板的每孔中放置 6~8 個圓頂結構。將培養板置於 37 °C 孵育 30 分鐘，讓基質固化，然後向每孔中加入適當的細胞培養基。
圓頂包埋快速操作
將未分化的人胃類器官包埋在 CultrexBME 的圓頂內。 按照人胃類器官培養方案，利用 CultrexRGF BME（貨號 3533-005-02）培養的未分化人胃類器官的代表性明場圖像。
不同的類器官培養方法不同，同樣的類器官不同實驗室也會有所差異。在開展實驗之前，我們需要根據各自的實驗目的，查詢文獻並進行培養方法的優化，選擇合適的 BME 包被/包埋方法。
類器官研究專用 Cultrex BME 2 型（貨號 3533-005-02/ 現貨 3533-010-02）文獻引用率高，代表高分同行評審文獻：（下滑查看更多）
· Hubrecht 研究所
Artegiani, B. et al.(2019) Probing the Tumor Suppressor Function of BAP1 in CRISPR- Engineered Human Liver Organoids.Cell Stem Cell 24:927.
· 史丹福大學
Co, J. et al.(2019) Controlling Epithelial Polarity: A Human Enteroid Model for Host- Pathogen Interactions.Cell Reports 26:2509.
· Gurdon 研究所
Broutier, L. et al.(2017) Human Primary Liver Cancer-derived Organoid Cultures for Disease Modelling and Drug Screening.Nature 23:1424.
· 加州大學洛杉磯分校
Phan, N. et al.(2019) A Simple High-throughput Approach Identifies Actionable Drug Sensitivities in Patient-derived Tumor Organoids.Communications Biology 2:78.
圖文來源：Bio-Techne
題圖來源：站酷海洛