【科學背景】
聚合物納米顆粒（NPs）由於其生物降解性，生物相容性以及高度可定製的藥物加載和釋放能力而被廣泛用於生物醫學應用。儘管有許多關於NP力學對納米生物相互作用（例如內在化，吸收，運輸和降解）影響的報導，但在與聚合物NP利用率相對應的條件下，還沒有系統地表徵聚合物NP力學。這種缺陷的根源在於，儘管原子力顯微鏡（AFM）非常適合表徵納米級材料（即NP），但在生理條件下（例如，緩衝液中的37°C）進行的實驗具有挑戰性，需要專用設備。雖然可以使用大量測量值來推斷NP的機械性質以了解生物學功能，但這種推斷所依據的假設是，懸浮在緩衝液中並加熱至生理溫度不會顯著改變NP的力學。這種假設適用於某些無機NP，例如由金屬和氧化物組成的那些。此外，對具有不同機械性能的二氧化矽納米膠囊的系統研究發現，吞噬作用和靶向腫瘤的過程對納米顆粒的硬度有很強的依賴性。
【科研摘要】
儘管可生物降解的聚酯納米粒子廣泛用於藥物遞送，並且有報導稱納米粒子力學對納米生物相互作用具有強大的影響，但在生理相關條件下，對這些納米粒子的力學卻缺乏系統的研究。最近，波士頓大學Keith A. Brown教授團隊報告使用原子力顯微鏡對聚乳酸和聚丙交酯乙交酯納米顆粒的壓痕實驗。雖然發現乾燥的納米顆粒在室溫下是剛性的，但是發現它們的彈性模量在模擬的生理條件下（即在37℃的水中）降低了多達30倍。差示掃描量熱法證實該軟化可歸因於納米顆粒的玻璃化轉變。結合機械和熱分析特性，研究了微型化，分子量和浸入水中的塑化效果。總的來說，這些實驗為實驗家們探索聚合物納米粒子力學與體內行為之間的關係提供了見識。
【圖文解析】
在典型的壓痕實驗中，如先前報導的那樣，通過納米沉澱合成了NP，然後將其滴鑄在塗有聚-1-賴氨酸（PLL）的蓋玻片上，以促進NP與底物的粘附。對於在水中進行的壓痕實驗，在整個合成，製備和實驗過程中，將NP浸入Milli-Q水中。在壓痕實驗中使用水代替緩衝液以避免NP脫離。為了進行機械錶徵，將蓋玻片放在AFM系統內的Peltier加熱元件上，並保持在固定的實驗溫度下。然後，使用AFM在敲擊模式下掃描表面以識別沒有NP的區域，以進行探針校準程序，然後再次掃描表面以識別分離的NP以進行機械錶徵（圖1a）。然後在分接模式下收集所選NP的高解析度圖像，以精確識別其頂點（圖1b）。定位顆粒頂點之後，對顆粒進行壓痕以產生力-壓痕曲線（圖1c），該曲線與修正的Hertzian接觸模型擬合，該模型考慮了NP直徑d（估計為顆粒的高度）和AFM探針直徑，以NP寬度w和d之差來衡量（圖1d）。
圖1.使用原子力顯微鏡（AFM）表徵納米顆粒（NP）的典型實驗程序。（a）低分子量聚乳酸（PLALMW）NP集合的調查圖像（高度通道），以識別孤立的NP（虛線框）。彩色條表示高度。（b）從（a）中選擇的孤立NP的高解析度AFM圖像的高度通道，以及穿過NP頂點的虛線。顏色表示（a）中顏色欄後面的高度。（c）（b）中NP的力曲線，力F與壓痕h的關係。粗綠線表示從中導出彈性模量E的接觸模型擬合。（d）AFM探針（白色）掃描位於基材（灰色）上的NP（綠色）時的示意圖。黑色粗線是（b）中虛線所示的切割線。表觀顆粒寬度w和來自成像的測得NP直徑d用於估計AFM探針直徑以進行分析。
為了區分在乾燥條件下區分大樣本和在模擬生理條件下區分NP的不同因素的貢獻（圖2a，b），對模型聚合物，低分子量PLA（PLALM，分子量Mw18–28 kDa，特性粘度0.25–0.35 dL/g）。首先，通過滴鑄PLALMW在乙腈中的溶液並使其在真空下乾燥一個月來製備3mm厚的PLALMW膜。然後在25°C下使用球形AFM探針（半徑= 920 nm）壓入乾燥的塊狀薄膜。塊狀聚合物薄膜的最終彈性模量E為4.7±0.5 GPa，與文獻值相吻合（圖2c）。
圖2.在生理條件下進行實驗時，區分本體聚合物與NP的因素。（a）與（b）固定在聚-1-賴氨酸處理的玻璃蓋玻片上的聚合物NP的AFM高度圖相比，幹散裝聚合物的示意圖。（c）塊狀聚合物薄膜中PLALMW的測得模量E，在空氣中測得的NPs，在水中測得的NPs以及在高溫下在水中測得的NPs，每個條形圖上都標明了實驗次數（n）。（d）水和空氣以及大塊PLALMW粉末中PLALMW NP的差示掃描量熱（DSC）熱分析圖。
有趣的是，壓痕實驗得到的E表明，儘管兩種材料都在水的存在下發生了軟化，但吸溼性更高的聚合物PLGA受到的影響更大（圖3a）。為了探索分子量在NP力學中的作用，對分子量為209 kDa，特性粘度為1.3–1.7 dL/g的高分子量PLA（PLAHMW）NP進行了一系列壓痕實驗。由於分子鏈長度的增加，如Flory-Fox關系所預測的，PLAHMW的所有條件（水中的NPs，空氣中的NPs和散裝粉末的Tg）都高於PLALMW的相應條件Tg。雖然在浸泡水中觀察到PLAHMW NP Tg降低，與PLALMW觀察到的Tg變化相當，但Tg仍高於37°C。這些壓痕實驗證實，即使在生理溫度下，水中的PLAHMW NP也呈玻璃態（圖3b）。
圖3.（a）25°C時水對PLALMW和聚丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）的NP E的影響。橙色條形圖表示在空氣中測得的NP的測得E，藍色表示在水中測得的NPs。（b）分子量對PLALMW和高分子量PLAHMW的NP E的影響，在空氣中25°C（橙色陰影線圖）和在水中37°C（藍色陰影線圖），其中n表示為每個條形圖。
水中的納米力學表徵複雜化，因為NP之間的附著力以及在水中的下層底物比在空氣中的附著力低，通常導致顆粒的拖曳和積聚。儘管顆粒的拖曳和積累可能使識別單個顆粒變得困難，但是一旦在適當的成像條件下識別了這些顆粒，就可以對其進行可靠的表徵。然而，在空氣中進行納米機械錶徵的挑戰較少，在這種情況下，毛細管效應使顆粒較不易發生尖端運動。因此，作者研究了在空氣中觀察橡膠狀NP力學的能力。為此，對PLALMW和PLGA在高於乾燥NP Tg的溫度T進行了壓痕實驗。具體而言，為PLALMW和PLGA選擇的T值分別為49.4和48°C，表示空氣中NPs Tg上方的溫度變化ΔT與在水中和37°C下為NPs測量的Tg之差相稱。有趣的是，對高於其Tg的乾燥NP進行的壓痕實驗產生的E值在GPa範圍內（圖4a），這表明NP仍處於玻璃態，即使DSC結果表明T> Tg。
圖4.空氣中高溫下的壓痕實驗。（a）空氣中PLALMW（頂部）和PLGA（底部）NP的測量E。綠色實心數據點表示AFM載物臺設定點溫度TS。虛線代表空氣中每個NP的峰值玻璃化轉變溫度Tg。對於兩個面板中最右邊的數據點，垂直上邊界代表與修改後的Hertzian模型擬合，而垂直下邊界則代表基於JKR的模型。（b）由AFM探針測得的溫度TP與TS的關係圖，在水（黑色）中以0.9×TS+ 3.1°C進行相應的線性擬合（虛線），在空氣（白色）中以相應的線性擬合（虛線）進行採集0.5×TS+ 10.7°C。空氣中實驗的斜率用於確定（a）中水平誤差線的最左邊界，以說明AFM尖端冷卻。（c）AFM探針使水和（d）空氣中的NP縮進的示意圖，其中加熱來自蓋玻片底物下方的平臺（用紅色箭頭表示）。
為了解釋當T> Tg時NP的明顯玻璃態，作者假設AFM探針在壓痕過程中正在冷卻空氣中的NP。為了研究這種潛在的熱傳遞，使用一系列功率譜密度（PSD）測量和等分定理，通過改變AFM臺設定點溫度TS來測量AFM探針溫度TP。當探針浸入水中時，其斜率TP與TS的線性擬合為0.9±0.3（65％置信區間）（圖4b），這表明來自載物臺的熱量已通過水有效地傳遞到探頭。驗證探頭的冷卻現象對於在空氣中升高的溫度下進行壓痕實驗至關重要。即，這表明當與AFM探針和底物都接觸時，NP不是等溫的（圖4c，d）。這一發現尤其適用於NP的內部熱梯度在Tg以下至Tg以上的實驗，這表明該顆粒部分處於玻璃態，部分處於橡膠態。NP中的剛度梯度可能會以任何現有接觸模型無法準確捕獲的方式改變接觸行為。儘管這些結果表明，在解釋空氣中升高的溫度下的機械測量結果時要格外謹慎，但探針和樣品溫度在水中的良好對應關係表明，這種偽影在水中不存在。
參考文獻：
doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c03004
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