胚胎植入前遺傳學診斷/篩查技術專家共識(2018版)

隨著輔助生殖技術臨床開展規模的日益擴大，以及細胞及分子遺傳學診斷技術的快速發展，胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)和植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening，PGS)技術迎來了快速的增長和發展。為使該項技術更加規範且有效地實施，經中國婦幼保健協會生育保健專業委員會、中國醫師協會生殖醫學專業委員會、中國醫師協會醫學遺傳學分會、中國遺傳學會遺傳諮詢分會和中國婦幼健康研究會生殖內分泌專業委員會專家討論，結合國際發展動態和國內臨床應用的實際情況，達成以下臨床和實驗室專家共識。

第一部分　PGD/PGS的臨床流程與質控

1　適應證和禁忌證

1.1　PGD的適應證

1.1.1　染色體異常
夫婦任一方或雙方攜帶染色體結構異常，包括相互易位、羅氏易位、倒位、複雜易位、致病性微缺失或微重複等。

1.1.2　單基因遺傳病
具有生育常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖隱性遺傳、X連鎖顯性遺傳、Y連鎖遺傳等遺傳病子代高風險的夫婦，且家族中的致病基因突變診斷明確或致病基因連鎖標記明確。

1.1.3　具有遺傳易感性的嚴重疾病
夫婦任一方或雙方攜帶有嚴重疾病的遺傳易感基因的致病突變，如遺傳性乳腺癌的BRCA1、BRCA2致病突變。

1.1.4　人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型
曾生育過需要進行骨髓移植治療的嚴重血液系統疾病患兒的夫婦，可以通過PGD選擇生育一個和先前患兒HLA配型相同的同胞，通過從新生兒臍帶血中採集造血幹細胞進行移植，救治患病同胞。

1.2　PGS的適應證

近期高通量遺傳檢測技術(PGS 2.0版)的研究和發展，對PGS的臨床意義提出了新的質疑，包括不同程度和部位胚胎染色體異常嵌合型的存在、臨床檢測技術的精準性、對移植胚胎的選擇和放棄的標準、PGS的活產率計算方式及其應用價值等，提示PGS的循證證據尚需進一步的研究和驗證，其指徵也面臨修正和更新。目前PGS可應用於以下幾個方面：

1.2.1　女方高齡(advanced maternal age，AMA)  女方年齡38歲及以上。

1.2.2　不明原因反覆自然流產(recurrent miscarriage，RM)  反覆自然流產2次及以上。

1.2.3　不明原因反覆種植失敗(recurrent implantation failure，RIF)　移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數4～6個或高評分囊胚數3個及以上均失敗。

1.2.4　嚴重畸精子症

1.3　PGD的禁忌證　有以下情況之一者，不得實施PGD技術：

1.3.1　目前基因診斷或基因定位不明的遺傳性疾病。

1.3.2　非疾病性狀的選擇，如性別、容貌、身高、膚色等。

1.3.3　其他不適宜實施PGD的情況。

1.4　其他幾種特殊情況

1.4.1　性染色體數目異常
如47，XYY、47，XXX等，產生性染色體異常後代的機率較低[1,2]，不建議實施PGD；而47，XXY生育後代染色體異常風險增加[3]，可酌情考慮是否實施PGD。

1.4.2　對於常見的染色體多態
如1qh＋、9qh＋、inv(9)(p12q13)、Yqh＋等，不建議PGD。

2　遺傳諮詢和知情同意

患者夫婦在選擇實施PGD/PGS前，需要接受至少一次的遺傳諮詢，使其充分了解自身的生育和遺傳風險，知曉現階段可能的醫學幹預措施及其利弊，自願選擇治療方式，並保存相關諮詢記錄資料。

2.1　病史採集及家系分析

包括收集患者及相關家系成員的原始臨床資料及遺傳檢測結果，繪製系譜圖；詢問夫婦雙方的疾病史、生育史、專科檢查及健康評估結果；對於HLA配型者，需評估患兒目前的病情及診治情況，判斷其病情是否允許等待。

2.2　風險評估

結合家系調查和遺傳檢測結果，以及相關疾病的一般遺傳發病規律，充分評估夫婦的再生育風險。

2.3　知情選擇

根據評估的生育風險告知可能的幹預措施，如產前診斷、PGD/PGS、配子捐贈等，以及現階段不同幹預技術方案的優缺點，讓夫婦自願選擇生育幹預措施。夫婦在選擇PGD/PGS周期治療前，需充分知曉整個過程中的各類風險，涉及常規體外受精的治療過程、PGD/PGS技術造成的胚胎活檢、冷凍復甦損傷、個別胚胎可能診斷不明、檢測後無可移植胚胎、染色體嵌合型胚胎發育潛能的不確定性、無法常規鑑別染色體結構異常的攜帶者、由於胚胎自身的生物學特性以及檢測技術的局限性可能導致誤診的風險、以及若獲得持續妊娠，需行產前診斷確診等。

3　胚胎移植

3.1　行PGD/PGS檢測後的胚胎，建議行單胚胎移植。

3.2　當本周期無完全正常的可移植胚胎時，患者經遺傳諮詢和知情同意後，可自願選擇移植非整倍體嵌合體異常胚胎[4]，並依順序優先選擇移植不良風險較小的嵌合型胚胎。

3.3　在對單基因疾病實施PGD時，攜帶致病基因突變但很可能不發病的胚胎可作為備選移植胚胎。

3.4　可選擇新鮮周期移植或者復甦周期移植。

4　隨訪

PGD胚胎移植後獲得持續妊娠者，需進行侵入性產前診斷。現階段不建議採用無創產前篩查的方法，並應隨訪妊娠的結局以及新生兒的情況。

5　臨床質控

5.1　夫婦在進入PGD/PGS治療周期前，需接受至少一次遺傳諮詢，並保存完整的諮詢記錄、知情同意書和病案記錄。

5.2　確定接受PGD/PGS周期治療的夫婦的臨床指徵合理且充分。

5.3　PGD獲得持續妊娠者，產前診斷結果與胚胎檢測結果符合率>98%。

5.4　對PGD/PGS的臨床結局分析，建議使用活產率/每起始周期的統計方法。

第二部分　胚胎實驗室的顯微操作與質控

1　授精方式的選擇

1.1　卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)

PGD/PGS周期建議採用ICSI授精方式，以最大限度地減少母源顆粒細胞和父源精子對下遊遺傳學檢測準確性的幹擾，特別是下遊檢測擬採用核酸擴增技術者。

1.2　常規體外受精(in vitro fertilization，IVF)

使用螢光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)方法進行胚胎遺傳學檢測時，也可採用IVF授精後形成的囊胚，但應警惕精子和其他細胞核的汙染。

2　活檢的時機

2.1　極體活檢

通過極體活檢進行PGD/PGS，可分析判定母源遺傳信息。

2.1.2　第一極體活檢：可在取卵後實施，也可在ICSI後0.5～2 h進行。

2.1.3　第二極體活檢：在ICSI後8～14 h第二極體排出後進行。

2.1.4　在ICSI受精後8～14 h內，可同時活檢獲取第一極體和第二極體。

2.2　卵裂期活檢

卵裂期活檢一般在授精後66～70 h進行，對此時發育至6～8細胞、碎片含量< 30%的胚胎進行活檢。通常活檢1個卵裂球，最多不超過2個。在卵裂期活檢後，胚胎仍可繼續生長發育2～3天，成為囊胚。在該時間段內若能完成胚胎遺傳學診斷，則可實行新鮮周期移植。

2.3　囊胚活檢

囊胚活檢對胚胎發育的潛力影響較小，已成為目前PGD/PGS的主要活檢方式。囊胚期活檢是在授精後第5～6天、囊胚充分擴張後進行。建議活檢囊胚評分應在4BB以上，活檢細胞數以5～10個為宜。通常囊胚活檢後的胚胎需立即冷凍保存，待胚胎遺傳學分析完成後，擇期對結果正常的胚胎進行復甦移植。

3　胚胎活檢

3.1　透明帶打孔

3.1.1　透明帶打孔的方法有機械法、Tyrodes酸法和雷射法。目前雷射法更為常用，在活檢時應儘量避免對細胞造成熱損傷。

3.1.2　機械法打孔和雷射法可以用於授精前的極體活檢，Tyrodes酸法可能對紡錘體產生不利影響。

3.1.3　卵裂期或囊胚期活檢可以採用機械法、Tyrodes酸法和雷射法。

3.1.4　囊胚活檢的透明帶打孔可以在授精後第3天、第5天、活檢前4 h或活檢時進行。

3.2　活檢細胞的數目　

應根據遺傳檢測的要求，單獨或同時移取第一或第二極體；卵裂期活檢應移取1～2個細胞。若需移取2個細胞，則活檢胚胎應包含≥ 6個細胞；囊胚活檢採集的滋養細胞數目應控制在5～10個。

3.3　二次活檢

反覆活檢將影響胚胎的發育潛力。但在首次活檢診斷不明時，可以考慮二次活檢(包括卵裂期胚胎和囊胚)；如果胚胎活檢後已冷凍，可以考慮復甦後再次活檢[5]。

3.4　選擇活檢的細胞　

在卵裂期活檢卵裂球時，應選擇移取有核且為單核的細胞，囊胚活檢應選擇遠離內細胞團的部位。

4　活檢胚胎的冷凍

在等待PGD/PGS遺傳學檢測結果時，需要對活檢後的胚胎進行冷凍保存。建議採用玻璃化冷凍技術，活檢後的卵裂期或囊胚期的冷凍方法與常規胚胎冷凍方法相同。

5　活檢樣本的預處理

5.1　核酸擴增法檢測的預處理

下遊採用核酸擴增法進行遺傳學檢測者，活檢所移取的細胞經過洗滌後應放入含有2.5 μL磷酸鹽緩衝液(或遺傳檢測試劑盒所要求的預裝試劑)的PCR管中，同時移取少許洗滌液到空白PCR管中作為空白對照。

5.2　FISH檢測的預處理

不同的細胞固定方法均可以獲得滿意的效果；在處理時應注意做好固定液的隔離防護措施。

6　胚胎活檢實驗室的質量控制

6.1　胚胎活檢環境的質量控制

6.1.1　同ICSI體外胚胎操作實驗室標準，在百級層流、37℃恆溫、覆蓋於無菌礦物油下的無菌培養液滴中進行。

6.1.2　為減少胚胎之間的相互汙染，必須確保每個微滴中僅包含一個胚胎，活檢針和活檢材料轉移吸管須無活檢細胞成分的殘留。

6.2　胚胎活檢人員的質量控制　

胚胎活檢技術人員應具備熟練的ICSI操作經驗，在操作中全程遵循嚴格的無菌原則，以防外源性汙染。

第三部分　遺傳實驗室的遺傳檢測與質控

根據胚胎遺傳檢測的靶標，又可分為基因水平的檢測和染色體水平的檢測。

1　基因水平的檢測

1.1　適用範圍

經過規範的臨床諮詢，明確具有單基因遺傳病高風險的夫婦；夫妻雙方或之一攜帶有嚴重疾病明確的遺傳易感基因致病突變；HLA配型選擇。

1.2　檢測策略和原則要求

1.2.1　為避免因擴增失敗、優勢擴增、等位基因脫扣(allele drop-out，ADO)、樣本汙染等導致的誤診或診斷不明，建議PGD的胚胎基因檢測應同時進行突變位點的直接分析和遺傳多態位點連鎖分析[6,7]。

1.2.2　用於連鎖分析的遺傳多態位點可以是短串聯重複序列(short tandem repeat，STR)或者單核苷酸多態位點(single nucleotide polymorphism，SNP)。

1.2.3　建議在致病突變位點上、下遊1 Mb的範圍內分別選擇至少2個可提供遺傳信息的多態位點，同時避免選擇同源性高、相鄰序列中GC含量高或有多聚核苷酸序列的SNP位點。

1.2.4　對於性連鎖遺傳病，建議加入性別指示位點的檢測。

1.2.5　對於HLA配型者，用於連鎖分析的遺傳多態位點需要覆蓋HLA-A、HLA-B、HLA-DRA和HLA-DQB1的上、下遊，在每個區域中至少選擇5個可提供遺傳信息的多態位點。

1.2.6　在進行遺傳多態位點連鎖分析時，需注意突變位點附近的基因組重組。

1.3　檢測方法

1.3.1　巢式PCR法
其中第一輪多重PCR應擴增多個目標位點(含突變位點以及連鎖遺傳的多態位點)。

1.3.2　全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)
又可分為基於PCR原理和非基於PCR原理的擴增方法。WGA擴增的產物可採用多種方法進行突變位點及遺傳連鎖位點的鑑定，包括螢光PCR、Sanger測序、單核苷酸多態微陣列晶片(SNP array)[8,9]、高通量測序(next generation sequencing，NGS)[6]以及聯合檢測等。

1.4　PGD檢測前的驗證

1.4.1　在施行PGD前，需要在家系樣本中對已知致病突變進行驗證。

1.4.2　應選擇突變位點上、下遊的多態位點，在家系樣本中進行連鎖分析，從中選擇能夠提供遺傳信息的位點建立單體型圖。

1.4.3　在單個細胞水平驗證PGD檢測方案的有效性

1.4.3.1　在實施PGD檢測前，需要在單個細胞上驗證方案的有效率，評估目標檢測位點擴增的有效性以及ADO率。

1.4.3.2　驗證樣本可以是淋巴細胞、顆粒細胞、口腔黏膜細胞、胚胎細胞等，應注意來源的細胞可能影響擴增的效率和ADO率。

1.4.3.3　採用卵裂期活檢者，每份驗證樣本應包含1個細胞；採用囊胚活檢者，每份驗證樣本應包含4～10個細胞。

1.4.3.4　若採用直接PCR擴增法，建議在50份驗證樣本(可能的話，包括攜帶有致病突變的細胞以及正常細胞)中進行預驗證檢測。

1.4.3.5　採用WGA法進行第一步擴增者，建議至少在10份驗證樣本中進行預驗證檢測。

1.4.3.6　擴增效率應>90%，ADO率應<10%。若ADO率較高，可適當增加上、下遊的連鎖遺傳多態位點進行分析[10]。

2　染色體水平的檢測

2.1　適用範圍

夫妻雙方或之一攜帶有染色體異常；醫療目的的性別選擇；胚胎植入前的非整倍體篩查。

2.2　檢測策略和原則要求

2.2.1　對於夫妻雙方或之一攜帶有染色體異常者，PGD可以僅針對異常染色體進行檢測，也可同時分析其他染色體的數目異常。

2.2.2　性別選擇可以用於基因診斷不明的性連鎖遺傳病。但對於基因診斷明確的家系，建議進行突變基因分析，不建議單純進行性別選擇。

2.2.3　對於Y連鎖單基因疾病，可僅進行性別選擇。

2.2.4　對於染色體結構易位，PGD檢測可不鑑別攜帶者。有條件的實驗室可以提供攜帶者檢測，但需要充分評估檢測所採用的技術。

2.2.5　對於胚胎非整倍體篩查，建議採用能夠同時分析所有染色體數目異常的方法(comprehensive chromosome screen ing，CCS)，不建議採用FISH技術。

2.3　檢測方法

2.3.1　核酸擴增法

2.3.1.1　巢式PCR法
首輪多重PCR應同時擴增目標染色體的特異性位點，第二輪定量PCR應進行各染色體位點拷貝數分析[11]。

2.3.1.2　WGA結合高通量遺傳檢測技術
在WGA檢測後，可採用多種高通量遺傳檢測技術進行染色體拷貝數檢測，如微陣列比較基因組雜交(array CGH)[12,13]、單核苷酸多態微陣列晶片(SNP array)[14,15]、高通量測序(NGS)[16,17]等。

2.3.2　FISH檢測
應針對檢測的目標染色體，選擇不同的核酸探針。在檢測染色體易位攜帶者所產生的胚胎時，所選的探針組合需要能夠識別所有可能的易位相關的染色體不平衡胚胎。當染色體易位片段較小、超出高通量遺傳學檢測技術的有效解析度時，應優先選擇FISH檢測。

2.4　臨床實施PGD/PGS前對於方案有效性的驗證

2.4.1　array CGH、SNP array、NGS等技術已有商品化試劑盒，具有標準化的操作流程和質控參數，本地實驗室在首次臨床應用前，需驗證檢測平臺的有效性和穩定性。通常無需對每個病例進行臨床前預實驗。

2.4.2　採用FISH進行染色體拷貝數分析，需提前驗證患者夫婦外周血中期染色體的核型，同時在間期核上檢測分析探針的螢光強度及特異性。

3　質量控制

各臨床PGD/PGS實驗室應根據自身的條件和特色，自主選擇檢測技術平臺。各種檢測方法均需建立標準操作規程(standard operating procedure，SOP)。不同的檢測技術平臺應根據具體流程的需要在實驗關鍵環節設置質控參數。本指南僅對PGD實驗室的一般質控措施提出以下建議：

3.1　採用核酸擴增法進行PGD/PGS檢測的實驗室需嚴格遵照《臨床基因擴增實驗室工作規範》的一般原則。

3.2　胚胎活檢的細胞及其在整個檢測流程中需具有清晰且唯一的編號，與胚胎一一對應。

3.3　採用核酸擴增法進行PGD/PGS檢測時，首次擴增步驟需要設置細胞洗滌液空白對照以及擴增試劑空白對照以評估可能的汙染及來源。

3.4　各種檢測技術需均建立SOP文件並遵照執行，並及時評估更新。

3.5　對於採用商品化試劑盒檢測技術如array CGH、SNP array、NGS等，需建立適用於本地實驗室的SOP程序和質控方法。

3.6　所有實驗操作過程中需要嚴格的雙人核對，實時記錄並籤字。

3.7　檢測結果數據需要兩人獨立分析判讀，最後由第三人審核判斷。未達成一致意見的胚胎應判讀為診斷不明。PGD中診斷不明的胚胎不建議移植。

3.8　應定期開展室內比對和室間比對質控，並做好記錄。

參考文獻：略。

文章來源：中華醫學遺傳學雜誌[J]; 2018, 38(2): 151-155.

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