矽-羅丹明適配體用於活性菌中RNA的共聚焦超解析度成像

2021-01-08 中國生物技術網

基因編碼的發光RNA適配體已成為觀察和跟蹤活細胞中RNA的有效工具。雖然已經開發出了少量跨越可見光波長區域的發光適配體，但據報導，這些適配體都還不能與先進的超分辨技術兼容，這主要是由於其小分子螢光體的光物理特性較差。

德國海德堡大學的Murat Sunbul團隊和Andres Jschke團隊合作開發了一種結合了矽羅丹明（SiRs）的發光RNA適配體（SiRA），利用這種具有優異光物理性質的適配體可以在活細胞成像實驗中觀察到細菌RNA的表達，並可以實現基於適配體的、螢光標記的mRNA在活細胞中的受激發射損耗（STED）超分辨成像，相關的研究內容去年已在The Journal of American Chemistry Society上發表，題為「SiRA: A Silicon Rhodamine-Binding Aptamer for Live-Cell Super-Resolution RNA Imaging」。

DOI:10.1021/jacs.9b02697

近日，兩個團隊的原作者將該實驗方案的詳細版本發表在Bio-protocol上，題為「Confocal and Super-resolution Imaging of RNA in Live Bacteria Using a Fluorogenic Silicon Rhodamine-binding Aptamer」。

DOI:10.21769/BioProtoc.3603

實驗中，研究人員首先製備了用於活細胞共聚焦和GFP-mRNA STED成像的大腸桿菌，通過加入IPTG溶液誘導細菌中mRNA的表達，與此同時製備多聚賴氨酸包被載玻片，接下來，對已經進行過誘導的大腸桿菌進行離心沉澱、懸浮培養、塗布、室溫孵育、清洗等操作，隨後加入含矽羅丹明螢光染料的M9成像溶液，直接準備成像。

然後打開488納米（綠色通道）和640納米（紅色通道）雷射，以進行點掃描共聚焦顯微鏡的螢光照明，並使用分別用於綠色通道和紅色通道的525/50 nm和700/75 nm發射濾光片，對大腸桿菌中的GFP-SIRA5mRNA進行拍攝成像（圖1）。

圖1. 使用共聚焦顯微鏡在活性大腸桿菌中進行GFP-mRNA成像的示例

最後，使用STED顯微鏡在活性大腸桿菌中對GFP-SiRA5mRNA進行成像（需要先對暗紅色的珠子進行成像以確定STED顯微鏡的解析度，樣本製備之前或同時進行），採集STED圖像後（圖2），關閉耗盡雷射器，拍攝共聚焦圖像。

圖2. 活性大腸桿菌中GFP-SiRA5mRNA的STED成像

本實驗方案使用基於質粒的表達系統，並在3'非翻譯區（UTR）處使用新型SiRA適配體（SiRA5）的串聯重複序列標記GFP-mRNA，該實驗方案可適用於任何質粒表達的RNA成像，但是考慮到RNA的表達水平以及半衰期，對於特定的實驗方案，這個方法可能需要進一步的優化。

來源：BioartReports

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