1. HSV-1感染的QTV研究
為了構建在HSV-1感染過程中宿主和病毒蛋白變化的全局圖，用HSV-1多次感染人角質細胞系(HaCaT)(圖1)，免疫螢光分析證實>95%的細胞被感染。我們使用Ten-plexTMTs和MS3來量化6個時間點上蛋白表達的變化(圖1A)，從而產生了迄今為止HSV-1複製周期中最完整的蛋白質組數據集，量化了6956個人類蛋白和67個典型HSV-1蛋白，並提供了在感染期間蛋白表達變化的全局視圖。我們對整個感染過程中的病毒蛋白表達進行時間分析，深入了解病毒與宿主蛋白的相互作用。
HSV-1感染導致496個人蛋白下調，34個蛋白上調。細胞蛋白質組最廣泛的變化發生在感染後期，這可能是由於病毒能夠強烈地影響宿主活性(圖1B)。目前已有多個已知在HSV-1感染期間特定下調的宿主靶標被證實，比如DNAPKcs(PRKDC)，幹擾素gamma-inducible蛋白質16(IFI16)和E3泛素蛋白連接酶等(圖1C-1D)。這些數據證實了在病毒感染期間蛋白和總RNA豐度的普遍下降(圖2A)，然而它也同時表明，豐度下降最大的蛋白是HSV-1特異性針對降解的蛋白，而不是抑制轉錄或翻譯(圖2A)。
(A) 實驗工作流程示意圖；(B) 對所有量化蛋白質進行層次聚類分析；(C) 所有蛋白質在18hpi處定量的散點圖；(D) 已知可降解蛋白質的時間概況；(E) 對感染HSV-1和 HSV-2菌株的HaCaT細胞裂解液進行免疫印跡，驗證(D)所示的時間圖譜
2. HSV-1感染後的生物信息學富集分析
使用DAVID軟體分析下調蛋白中顯著富集的途徑(圖2B)。結果顯示，泛素樣(Ubl)偶聯途徑顯著富集，與已知皰疹病毒靶向某些途徑導致細胞降解的情況一致，而對上調顯著的宿主蛋白進行類似分析沒有發現任何富集的途徑。
圖2 HSV-1感染過程中宿主細胞通路的調控
(A) 散點圖比較蛋白質豐度與總RNA、新合成RNA和核糖體蛋白；(B) 在感染期間的任何時間對所有人類蛋白下調2倍以上的蛋白進行DAVID富集分析；(C) 泛素樣(Ubl)偶聯途徑下調蛋白的時間譜示例；(D) 2hpi定量的所有蛋白散點圖；(E) HSV -1感染的所有蛋白在2 hpi時下調大於4倍的時間分布
3. 在HSV-1感染後，識別宿主的靶點迅速消失
之前已有研究表明，病毒感染早期表達下調的宿主蛋白中可能富含抗病毒活性因子，因此研究人員分析了在HSV-1感染後最早時間點下調>4倍的蛋白(圖2D和2E)中的其中6種，其中有4個（methyl-CpG-binding域蛋白1 (MBD1)、MORC3、TRIM27和鋅指蛋白462（ZNF462））被證明在感染HSV-1的細胞中表達顯著減少。另外2種蛋白(senataxin 和GOPC)此前尚未被確定為HSV -1介導的降解靶點。
4. pUL56結合NEDD4家族的泛素連接酶和GOPC
ITCH是泛素連接酶NEDD4家族的一員，在HSV-1感染期間迅速消失(圖1B-1E)。來自HSV-1和HSV-2的pUL56蛋白與ITCH和NEDD4相互作用，導致這些靶點被蛋白酶體降解。pUL56是在純化病毒粒子中發現的尾部錨定II型膜蛋白，包含三個PPXY基序，可能通過與NEDD4中的WW結構域結合從而發生相互作用。pUL56不包含任何賴氨酸殘基，因此是很難被泛素化降解的。為了進一步表徵pUL56的結合過程，我們對表達GFP標記的pUL56或GFP的細胞進行了胺基酸的穩定同位素標記(SILAC)免疫沉澱-質譜(IP-MS)分析(圖3A)，發現泛素連接酶NEDD4家族的幾個成員在和多轉運蛋白顆粒複合物II (TRAPPCII)亞基被富集，並且GOPC還被確定為pUL56的結合分子。共沉澱分析表明，被純化穀胱甘肽s -轉移酶(GST)標記的pUL56胞質結構域能夠結合純化的GOPC，證實這兩種蛋白的直接相互作用(圖3B)，GOPC的結構顯示27-236殘基和N端捲曲區域足以與pUL56結合(圖3D)。綜上所述，這些結果探明了pUL56結合GOPC和NEDD4家族泛素連接酶的模型。
圖5 pUL56結合GOPC和細胞泛素連接酶
(A) 用GFP標記的pUL56或GFP單獨轉染標記的HEK293T細胞進行免疫沉澱(IP)；(B) 使用純化重組成分進行下拉實驗，證明GST標記的pUL56與GOPC的捲曲區域直接相互作用；(C) 帶GFP標記的pUL56 IP實驗結果；(D) pUL56和GOPC連接的示意圖。
5. pUL56通過蛋白酶體介導GOPC的降解
為了確定GOPC降解的機制，研究人員用野生型(WT) HSV-1或缺乏pUL56表達的HSV-1（ΔUL56）質粒感染細胞。免疫螢光結果顯示，在HSV-1感染的細胞中，MG132（蛋白水解抑制劑）抑制了pUL56依賴的GOPC水解(圖4B)。為了進一步驗證NEDD4家族E3泛素連接酶對pUL56降解GOPC的重要性，研究人員構建了一種新的重組病毒，將所有三個pUL56 PPXY基序突變為AAXA。研究表明，GOPC的降解依賴於pUL56的PPXY基序，因為在表達GFP-pUL56-AAXA的細胞中，GOPC並未被完全降解(圖4C)。在WT pUL56存在的情況下，GOPC與NEDD4-WW共沉澱形成一個三聯複合體，說明其中GOPC與NEDD4的結合是由pUL56介導的(圖4E)。總的來說，這些數據表明，pUL56招募NEDD4家族泛素連接酶來介導GOPC的泛素化和蛋白酶體降解。
圖4 pUL56對於GOPC的降解是必要的
(A) HaCaT細胞的在MOI 10期感染病毒。2小時後，用MG132或DMSO載體替換培養基，繼續感染。在16hpi收集細胞裂解液，用免疫印跡法檢測蛋白；(B) 在MOI 1期感染HFF hTERT細胞，然後按照(A)中所述，用MG132或載體處理HFF hTERT細胞。在6 hpi時，固定標本並染色；(C) 用GFP-pUL56或GFP-pUL56- AAXA表達質粒轉染U2-OS細胞；(D) 用病毒在MOI 10期感染HaCaT細胞，收集16 hpi細胞裂解液，用免疫印跡法檢測指示蛋白；(E) 用YFP標記的NEDD4-WW結構域、myc標記的GOPC和未標記的pUL56或pUL56- AAXA表達質粒轉染HEK293T細胞。對樣品進行IP檢測；(F) 將HA標記的泛素(HA-Ub)和myc-GOPC表達質粒一起轉染HEK293T細胞
6. HSV-1在細胞培養期間的複製不依賴於pUL56
在HSV-1感染期間，細胞中GOPC的快速減少意味著去除這種宿主蛋白對病毒的有效複製很重要。然而，HSV-1 ΔUL56的生長動力學與HSV-1 WT的生長動力學基本相同(圖5A)，在感染期間，內源性的GOPC水平保持不變。這些數據表明，在細胞培養中，pUL56對於HSV-1的複製是可調節的。pUL56可能參與調節了對HSV-1的抗病毒免疫反應，就像許多皰疹病毒蛋白一樣，這些蛋白在細胞培養中是可有可無的，但在體內複製很重要。
圖5 pUL56降解目標的識別
(A) 用HSV-1 WT和HSV-1ΔUL56感染HaCaT細胞，MOI 10期，在指定時間點用空斑試驗測定感染病毒總數；(B) 重複生物標本中HSV-1 WT和HSV-1 ΔUL56在HaCaT、HFF、和Vero細胞中的空斑分析；(C) 測量(B)的菌斑直徑，並歸一化至HSV-1 WT的平均值；(D) 蛋白質組工作流程示意圖；(E) 所有蛋白質定量散點圖；(F) 與mock相比，HSV-1 WT表達下調>2倍的蛋白以及HSV-1 ΔUL56 >表達上調2倍的蛋白。
7. 鑑定被pUL56特異性耗盡的宿主蛋白
為了鑑定被pUL56消耗的細胞蛋白，我們用HSV-1 WT或ΔUL56感染HaCaT細胞，然後採用基於TMT的蛋白質組學分析(圖7D)。我們發現在被量化的7696個人類蛋白中，只有少數蛋白在ΔUL56感染之後表現出顯著的豐度變化，觀察到的最大變化是GOPC(圖7E和7F)。
8. pUL56活性改變了質膜蛋白質組
調節細胞表面的蛋白質是多種病毒使用的一種免疫逃避策略，因此我們利用質膜實驗分析了細胞感染HSV-1 WT或ΔUL56複製的早期階段宿主蛋白的表達(圖6)。數據的分級聚類鑑定出了HSV-1 WT感染細胞的質膜上豐度較低的宿主蛋白，而這些蛋白表達被pUL56缺失所拯救(圖6B)。這些蛋白包括免疫信號蛋白TLR2、白介素-18r1(IL18R1)、DUOX1(雙氧化酶1)和溶質載體(SLC)家族的一些成員(圖6B和6C)。WT pUL56的表達降低了細胞表面TLR2表達，但不影響細胞內的表達水平(圖6D)，表明pUL56調節TLR2亞細胞定位，而不是針對其降解。
圖6 pUL56通過控制宿主轉運到質膜來調節免疫受體
(A) 實驗工作流程示意圖；(B) 對兩兩比較的摺疊式變化值進行層次聚類分析；(C) 示例蛋白的譜圖顯示HSV-1 WT下調>2倍和HSV-1 ΔUL56挽救>2倍；(D) 用FLAG-TLR2和pUL56或pUL56- AAXA表達質粒轉染U2-OS細胞。
9. TLR2細胞表面表達依賴於GOPC
為了探究細胞表面TLR2的丟失是否由於GOPC介導的轉運中斷，研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯生成了GOPC敲除的HaCaT細胞。並且還使用了基於TMT的質膜分析方法，針對GOPC生成了三個獨立單細胞敲除克隆進行質膜分析(圖7A和7B)。在3個獨立的GOPC敲除克隆中，有4個蛋白平均下調>2倍，其中TLR2的下調最為顯著 (圖7C和7D)，流式細胞術進一步證實了缺乏GOPC的細胞中TLR2的缺失。正常HaCaT細胞包括TLR2+群體，而所有三個GOPC敲除克隆的細胞表面TLR2都降低了(圖7E)。綜上所述，這些數據表明，TLR2在角質細胞表面的表達依賴於GOPC。
圖7 GOPC對於TLR2在質膜上的表達很重要
(A)免疫印跡分析GOPC敲除細胞；(B)實驗工作流程示意圖；(C)比較3個GOPC敲除細胞系和WT HaCaT細胞的表達平均值；(D)每個獨立細胞系中被下調>2倍的蛋白質的圖譜；(E)流式細胞術分析HaCaT WT細胞和3個GOPC敲除克隆的質膜TLR2水平。
在這項研究中，我們結合了三個強大的蛋白質組學技術：QTV(圖1、2和5)，免疫親和實驗(圖3)和質膜蛋白質組學(圖6和圖7)，發現HSV-1 pUL56促進了宿主細胞GOPC蛋白降解，從而降低了大量的重要免疫信號分子（如TLR2）在感染細胞質膜的表達。生化實驗和細胞生物學實驗(圖3，圖4、5、7)證實，pUL56 與GOPC結合，同時還需要NEDD4家族的泛素連接酶來刺激GOPC泛素化降解，從而導致細胞表面蛋白質組的變化。
1.對HSV-1感染的一些見解
本文提供的多重定量蛋白質組學數據是迄今為止HSV-1感染後宿主細胞蛋白質組變化最全面的分析，包括了來自全細胞樣品的約7,000種宿主蛋白和在三個獨立的數據集中定量的約700種質膜蛋白。將全細胞蛋白質組學數據與已發表的轉錄組數據以及質膜蛋白質組學實驗結果進行比較，我們可以得出有趣的結果：全細胞樣品中HSV-1介導的蛋白質下調主要與降解相關，而質膜中蛋白質的下調卻主要與細胞內螯合相關。這些觀察將需要在未來的研究中進一步證實，例如通過使用蛋白質降解抑制劑或免疫螢光顯微鏡分析HSV-1感染的蛋白質定位情況。
本文的QTV數據還為HSV-1蛋白產生動力學的研究提供了重要視角。K-means分析確定了五個不同的蛋白質表達譜。我們在同一類別（Tp2）中發現了早期基因，這大概是由於我們以2 hpi作為最早的時間點。但這可能掩蓋了早期基因類別動力學曲線中的某些差異，而且晚期基因似乎聚集在三個不同的組中。
HSV-1蛋白豐度的動力學分析還確定了ICP47（US12）具有單獨的時間分布。所有其他病毒蛋白在整個感染過程中其豐度都會增加，而ICP47的數量在感染過程中會提前達到峰值，隨後被下調。ICP47結合併抑制帶有抗原肽（TAP）的MHC-1複合物，從而預防肽出現在細胞表面並促進免疫逃逸。ICP47在感染過程中的表達變化可以通過精確調節細胞表面的MHC-1水平，從而實現維持CD8+ T細胞逃逸與抑制自然殺傷細胞（NK）激活之間的平衡。
2. HSV-1pUL56通過募集細胞E3 連接酶降解GOPC
缺乏pUL56的HSV-1病毒在動物模型中的毒性減弱，儘管該蛋白對於在培養細胞中進行病毒複製是必需的（圖7A-7C）。我們的數據提供了一種分子機制，即通過促進GOPC的降解以及下調感染細胞表面免疫信號分子表達，pUL56可以增強感染過程中的毒力。
先前來自HSV-1和HSV-2的研究表明pUL56與ITCH和NEDD4相互作用，導致GOPC的降解，但這種作用機制仍然不清楚。我們的IP-MS數據顯示pUL56可以結合多個細胞的NEDD4家族泛素連接酶和運輸因子GOPC（圖3A），還直接結合到GOPC的捲曲螺旋區域（圖3B）。此外，結果顯示pUL56結合NEDD4的PPXY基序是GOPC降解所必需的（圖4C和4D），pUL56可以同時結合GOPC和NEDD4（圖4E），並且pUL56也可以刺激GOPC的泛素化（圖4F）。總之，這些數據表明pUL56充當將GOPC和NEDD4家族泛素連接酶聚集在一起的支架，以促進GOPC泛素化和蛋白酶體降解。
GOPC在HSV-1 WT感染期間迅速降解（圖2D），在HSV-1 ΔUL56感染期間GOPC的豐度得以恢復（圖4A，4B，5E和5F）。比較HSV-1 WT與ΔUL56的感染結果，其他幾種蛋白質的表達也得到挽救。這可能反映了降解可能是由pUL56直接介導導致，也可能是GOPC喪失引起的間接後果。
3.HSV-1降解轉運因子以修飾感染細胞的表面
許多病毒會改變被感染細胞的表面以調節宿主反應。例如，HIV-1 Vpu募集E3泛素連接酶以促進幾種細胞表面蛋白的泛素化和降解。除此之外，已有研究顯示多種HCMV蛋白通過不同的機制以限制MHC-1和NK細胞受體的細胞表面呈遞。我們現在已經確定，至少部分HSV1 pUL56通過特異性降解細胞運輸因子GOPC來修飾包括免疫信號蛋白TLR2和IL18受體在內的幾種宿主蛋白的表面豐度。此外，我們已經證明了在未感染的人類角質細胞中，TLR2的細胞表面表達依賴於GOPC。
TLR2在天然HSV感染中的作用尚不清楚，有證據表明TLR2對控制感染很重要，而且TLR2的激活會增加小鼠HSV感染模型的免疫反應。除了本文中證實的在感染細胞中pUL56調節細胞表面TLR2水平外，其他研究也證明了其他HSV-1蛋白可抑制TLR2活性，包括ICP0和pUS3，pUL56和其他病毒蛋白對TLR2的調節如何影響HSV感染的發病機制有待進一步研究。GOPC可能是病毒調節的常見靶標，因為有研究顯示人類16型乳頭瘤病毒E6蛋白結合GOPC並通過宿主E3泛素連接酶E6AP介導其降解。此外，經典的豬瘟病毒NS2蛋白在酵母雙雜交篩選中結合了GOPC，儘管尚未確定GOPC在感染該病毒期間是否被降解。
來自馬皰疹病毒1型（EHV-1）和4型（EHV-4）的pUL56與HSV-1 pUL56僅具有20％的同一性，但兩者均為具有多個PPXY基序且幾乎沒有或沒有胞質的II型跨膜蛋白賴氨酸殘基。目前已有研究顯示EHV-1和EHV-4均以pUL56依賴性方式下調了感染細胞表面的MHC-1。同樣，來自人類皰疹病毒6A（HHV-6A）的U24是含有PPXY基序的尾部錨定（II型）膜蛋白，並已被證明可下調T細胞受體表達。此外，還有研究顯示HCMV UL42結合併刺激泛素介導的ITCH降解。因此，含PPXY基序的病毒編碼的II型跨膜蛋白募集NEDD4家族泛素連接酶可能是感染HSV宿主細胞中調控細胞膜運輸途徑的保守機制。
總之，我們的數據為理解HSV與宿主細胞的相互作用提供了廣泛的資源。重要的是，我們確定了pUL56靶向GOPC進行蛋白酶體降解，從而從質膜上去除了免疫信號分子。這代表了一種有效機制，通過該機制，HSV-1可以重塑被感染細胞的表面。其他病毒對GOPC的降解可能代表了一種調節感染細胞的細胞表面以逃避宿主免疫監視的通用機制。