RNAi(RNA interference，RNAi)是通過實驗手段向細胞內導入雙鏈RNA(double-stand RNA，dsRNA)或者細胞內源性產生一些短片段的雙鏈RNA，這些短片段的雙鏈RNA通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異地阻斷體內特定基因的表達，使細胞出現特定基因缺失的表型。由於這種現象的作用為點發生在轉錄後，故又稱為轉錄後基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。
小的幹涉RNA(small interfer-ence RNA ,siRNA) 是在RNA幹涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個核苷酸組成，就是這種短片段雙鏈RNA分子，能夠以序列同源互補的mRNA為靶目標，降解特定的mRNA，最終使相應的基因沉默，達到抑制蛋白質翻譯的目的。
RNAi(RNA interference，RNAi)給基因功能研究帶來了巨大的技術革新，是基因功能研究和基因治療研究的熱點，對生物學和醫學領域產生了難以預料的影響。在2001年被《Science》雜誌評為最重要的成果之一；在2002年《Nature》雜誌將RNAi評為年度重大科技成果之一。Craig Mello也因為在RNAi研究上的卓越貢獻而獲得了2006年諾貝爾生理學或醫學獎。何謂RNAi？也許要從RNAi的發現開始講起！
Craig Mello
奇妙的發現
1990年由Jorgensen研究小組在對矮牽牛（petunias）進行的研究時，研究人員將編碼紫色色素的多拷貝基因轉入矮牽牛中，但是結果卻令他們大吃一驚。矮牽牛並沒有產生預期的深紫色花，相反的，卻產生了白色和白紫色雜色的矮牽牛花。研究人員很奇怪為什麼不但沒有產生深紫色的花，連花本身的淡紫色都被抑制，產生了白色花。這種現象被命名為協同抑制（cosuppression），顧名思義就是導入的基因和其相似的內源基因同時都被抑制了。
1992年，Romano在粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)中發現，外源導人基因可以抑制具有同源序列的內源基因的表達。研究人員對dsRNA能夠導致基因沉默引起高度重視是在1995年。1995年Guo和Kemphues博士也在秀麗新小杆線蟲中發現了RNA的幹擾現象。Guo試圖證明par-1基因的失活會破壞線蟲第一次卵裂的不對稱性，她在關閉par-1基因的表達時使用了反義技術，即注入反義RNA，使反義RNA和par-1基因的轉錄物雜交，從而阻斷蛋白的翻譯過程。但令她驚訝的是在她的對照試驗中順義RNA也同樣使par-1基因的表達沉默了。但Guo並不能對此現象作出合理的解釋，直到1998年，華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和麻薩諸塞大學癌症中心的Craig Mello才揭開這個未解之謎。Mello等人通過注射與秀麗新小杆線蟲機體同源基因（靶基因）的雙鏈RNA，阻斷了靶基因的表達。並將其命名為RNA幹擾(RNA interference，RNAi)。Mello等人將體外轉錄得到的單鏈RNA純化後注射線蟲時，基因抑制效應變得十分微弱，而經過純化的雙鏈RNA能夠高效地特異性阻斷同源基因的表達。
隨後關於RNAi現象的研究表明，在植物、果蠅、錐蟲、渦蟲等許多生物中都存在此種現象。1999年，Tuschl等研究人員報導了在哺乳動物中也存在RNAi現象，只是導入的RNA是一種小的幹擾RNA（small interfering RNA; siRNA）。2001年，Berstein等研究人員提出，只有22個核苷酸的siRNA才能特異性的阻斷dsRNA，同時Berstein還在體內發現了一個分解dsRNA為siRNA的酶，稱為DICER酶。
RNAi作用機制與研究
RNAi的作用分為3個階段：起始階段、效應階段、擴增階段。
dsRNA可以是一個單鏈RNA分子回折，自身互補形成分子內雙鏈；也可以是分開的2個RNA分子互補形成的分子間雙鏈。當細胞中的dsRNA擴增達到一定量時，可以被特異性的雙鏈RNA內切酶——Dicer酶識別，在ATP的參與下被切割成約21～23個核苷酸的片段，形成siRNA分子，然後識別生物體內與之同源的靶mRNA序列，啟動RNAi效應。siRNA與特異性蛋白結合後解鏈，其反義鏈與核酶複合物內切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白4種組分結合，形成誘導RNA沉默的複合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。在ATP的激活下，活化後的RISC通過鹼基配對的方式結合到生物體內的靶mRNA上。細胞中的RNA可以在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRPs）作用下，以siRNA為引物，目的mRNA為模板合成大量的dsRNA，後者又可作為RISC的底物而被降解形成新的siRNA，新siRNA又可以進入上述循環，使信號放大。此外，siRNA還可以在RdRPs的催化下進行自我複製，從而放大其生物學效應。
科研人員並不滿足於簡單的發現了RNAi的作用機制。一種新技術發現的最大價值在於實際上的應用。2006年5月《Nature》雜誌首次發表RNAi在非人類靈長類動物中的試驗結果。研究人員通過RNAi技術沉默了一個相關致病基因，這項研究成果為開展後續研究提供了重要依據。來自全球領先的RNAi療法公司Alnylam Pharmaceuticals的Tracy Zimmermann和其他研究人員設計了載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）基因的siRNA。載脂蛋白B主要在肝和小腸中表達，參與低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的合成、裝配和分泌。載脂蛋白B水平的增高會導致心血管疾病的患病風險增加。用傳統的藥物治療方法很難控制載脂蛋白B的水平。研究人員將siRNAs包裹在核酸脂肪微粒（nucleic acid lipid particles）中，同時包被外殼以防止siRNA被降解。將這種siRNAs靜脈注射到短尾猴中（cynomolgus monkeys），單次劑量1mg/kg或者2.5mg/kg；給予單一劑量siRNA注射24小時後，載脂蛋白B、血清膽固醇和低密度脂蛋白水平明顯降低；注射48小時後，載脂蛋白BmRNA最大沉默量超過90%以上。
這是首次在非人類靈長類動物中單次單劑量給予siRNA的相關研究。經過11天的觀察，人們看到了siRNA在治療疾病上的潛力，但這次試驗由於是單一劑量，需要進一步的多劑量相關數據，證明RNAi治療的安全性。
2007年在《Nature》雜誌上John Matthias等人發表了一篇文章，該文章研究表明RNAi介導的基因沉默並不會干擾內源性miRNA路徑。
在John Matthias等人發表的新成果中，研究人員在嚙齒類動物身上給予合成的siRNA可以有效抑制肝細胞靶基因表達，獲得治療性的基因沉默效果，並不會影響內源性的miRNA的途徑。在前期RNAi的研究中，研究人員都是利用逆轉錄病毒傳遞編碼shRNA的基因，進一步加工成siRNA，一旦這個基因結合到細胞DNA上，shRNA就會合成，從細胞核傳遞到細胞質。有研究表明，大量的shRNA會阻斷細胞miRNA路徑，影響miRNA的水平和活性。由於沒有正常的功能性miRNA，小鼠會死亡。曾經也有研究人員給予低劑量的shRNA，但因為一旦shNRA基因結合到宿主細胞DNA上，它的表達期限就很長，雖然解決了毒性反應問題，但劑量難以調控，應用上依舊會存在問題。John Matthias等人是將合成的siRNA直接傳遞到細胞質，不會影響內源性miRNA水平和活性。
研究人員給予的合成siRNA主要靶基因是肝細胞的兩個特殊基因：載脂蛋白和因子VII，研究表明設計合成的siRNA能有效抑制80%的靶基因，而且對肝細胞表達的內源性miRNAs（miR-122、miR-16、let-7a）的水平和活性無明顯影響。而且倉鼠的重複給藥實驗也表明，給予siRNA可以使Scap基因獲得長時間的基因沉默，而對內源性miR-122的水平無任何影響。這項動物試驗證明了直接給予合成的siRNA是一種具有潛力的、安全有效的治療方法，對於一些難治性的疾病如癌症也提供了一種新的治療思路。
三種傳遞siRNA方法
從發現至今，科學家希望能阻斷基因表達的RNAi技術可用於治療目前無法解決的疑難疾病。
毫無疑問RNAi具有巨大的治療潛力，但是利用RNAi技術治療存在一個巨大的障礙，那就是如何安全有效地將siRNA傳遞到特定的體內靶細胞中去。
紐約愛因斯坦醫學院的Cy Stein博士稱，大自然不歡迎外源的寡核苷酸進入細胞，這可以說是生命的底線之一。
目前傳遞siRNA的方法層出不窮，總體概括可以分為三類：DNA或者病毒載體、定點注射以及合成修飾包裝成膠囊。在這三種方法中，利用DNA重組技術看似是最好的方法，但是利用DNA或者病毒載體只是一味的解決了投遞過程的瓶頸問題。利用DNA或者病毒載體能夠成功的敲除某個細胞裡的基因，但是這種方法會把正常組織細胞裡的基因也抑制掉，在這個敲除的過程中，特異性有待商榷。
科學家針對上述特異性的問題提出了針對特定的組織局部傳遞siRNA的直接方法，即定點注射。定點注射對於某些單一基因引起的疾病是最佳的選擇。但很多疾病是由多種基因引起，這樣多數疾病的靶基因都不適合用DNA重組技術和直接傳遞技術。
經過科學家的多年努力，卓有成效的是第三傳遞方法即合成修飾包裝成膠囊。2009年《Nature》雜誌報導了關於傳遞siRNA新方法的文章。麻省大學醫學院分子醫學系Myriam Aouadi等人找到了一種安全有效的將siRNA傳遞到巨噬細胞中的方法。研究人員選擇巨噬細胞是因為巨噬細胞一直是RNAi治療的研究熱點，而且巨噬細胞可以促進多種疾病的炎症反應,例如類風溼關節炎、腸炎和糖尿病。研究人員用β1，3-D葡聚糖包裹siRNA，被包裹的siRNA在體外和小鼠體內均具有沉默基因的作用。研究人員給由脂多糖誘導的炎症模型小鼠口服這種包含siRNA的葡聚糖顆粒，最少siRNA劑量為20ug/kg，siRNA消耗巨噬細胞中TNF-α的mRNA，降低血清中TNF-α的水平。研究發現接受了葡聚糖-siRNA顆粒治療的小鼠存活率提高，能有效抑制全身性炎症。這一新的RNAi技術為研究人員研發其他類型的siRNA藥物提供了一個很好的思路，為應用RNAi治療疾病掃清了siRNA安全有效傳遞的障礙。
RNAi在醫學上的應用
從1990年第一次在植物中發現了RNAi現象到2001年《Nature》首次報導哺乳動物培養細胞中通過siRNA成功誘導了特異性靶基因表達沉默，RNAi技術已經成為一項有巨大醫學應用潛力的前沿技術，已經成功的從植物研究發展到哺乳動物的相關研究。
在功能基因組研究中，需要對特定基因進行功能喪失或降低突變，以確定其功能。由於RNAi可以使特異的mRNA發生沉默，獲得功能喪失或基因突變株。與傳統的基因敲除方法相比，RNAi的方法具有明顯優點——高效、周期短、特異性強、操作簡單。例如在生產轉基因動物上，使用RNAi方法培育轉基因敲除小鼠只需要4個月時間，用傳統的方法生產基因敲除小鼠至少需要一年時間、甚至更久，RNAi比傳統的敲除方法具有更多的優勢。
從RNAi的功能基因組研究到治療的試驗性研究，科學家經過了一個艱辛的過程。RNAi最主要的醫學應用表現在對病毒、腫瘤的治療方面。2002年Lee等人在《Nature Biotechnology》發表的研究表明，用siRNA抑制愛滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的一些基因，如p24、vif、nef、tat、rev可阻止HIV在細胞內複製；抑制HIV的受體CD4和CD8a或輔助受體CXCR4或CCR5或病毒結構Gag蛋白的表達，可阻礙HIV感染細胞。同年，Novina等人在《Nature Medicine》上發表文章，稱在實驗中針對人類免疫缺陷病毒合成的siRNA可特異地沉默HIV-1細胞受體CD4、病毒結構蛋白Gag和調節蛋白Nef。研究結果顯示siRNA可以有效抑制HIV-1複製周期的每個環節。RNAi技術不但可以應用在HIV上，在B肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）上的報導也層出不窮。2003年McCaffrey等人主要針對HBV基因組設計siRNA，通過轉染HBV siRNA表達質粒後，研究人員發現在小鼠肝臟中HBV成功受到抑制。
腫瘤是一種難治性疾病，用傳統藥物治療的效果並不顯著。新技術的出現必然帶動疾病治療方法上的革新，漸漸的用RNAi方法治療腫瘤成為了研究的熱點。2007年Heidel等人通過對短尾猴靜脈注射包含針對核糖核苷酸還原酶M2亞基的siRNA的微粒，劑量3～9mg/kg siRNA。研究結果顯示短尾猴在3～9mg/kg siRNA劑量下有很好的耐受性。在27mg/kg siRNA劑量下，血清尿素氮和肌酐水平升高，具有腎毒性；轉氨酶有輕度升高，具有輕微肝毒性。這種肝腎毒性主要由於siRNA劑量升高引起。動物試驗的可喜結果讓一些藥物公司也投入了siRNA藥物研發的行列中，由Calando Pharmaceuticals公司申請的CALAA-01藥物治療實體腫瘤的安全性臨床試驗正式啟動。CALAA-01藥物的活性成分是siRNA，包被在顆粒中防止核酸降解，以便順利到達腫瘤細胞靶基因。siRNA的主要靶基因是核糖核苷酸還原酶M2亞基，siRNA通過RNAi作用降低核糖核苷酸還原酶M2亞基的表達，達到抑制腫瘤生長，縮小腫瘤體積的作用。目前試驗處於進行階段，試驗結果值得期待。
RNAi從發現到應用是每一個新技術必經的發展歷程。在RNAi的應用過程中，遇到研發瓶頸等問題，在所難免。但RNAi導入率不高、穩定性差並不能掩蓋它的諸多優點。RNAi不僅推動了後基因組時代的發展，在發現疾病相關基因、疾病治療和藥物篩選研發上都起到了積極的作用。