王蘋 吳曉盼 賈志蓉 吳鏑 韓家峰 高華方
（吉林大學第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，博奧生物有限公司）
由於導致語前聾的環境因素的存在，有時無法判斷患者是否為遺傳性聾，同時耳蝸結構複雜，耳聾聽力表現難以區分，常規的電生理檢測或生化檢測均不能從病因學上給出滿意的解釋。這一切，都決定了遺傳性耳聾基因檢測是目前最為有效的病因學分析方法之一。遺傳性耳聾基因檢測，就是通過分析被檢者的DNA，確認與耳聾相關的基因是否存在缺陷，從而為耳聾的臨床診斷提供依據。另外，耳聾基因能檢測也可用於耳聾發病風險的評估，鑑別致病基因的攜帶者，進行產前診斷或預後判斷。基因檢測比傳統檢查擁有更高的準確性、更遠的前瞻性，它首次使人們面對耳聾從只能患病後被動治療，而轉為可以提前主動的預防和幹預。
1. 中國人群遺傳性耳聾相關基因流行病學概況
最近的研究表明在中國相當一部分遺傳性耳聾僅由為數不多的基因突變引起，以下就是我國遺傳性耳聾患者所涉及的主要基因。
1.1 GJB2基因
GJB2基因突變導致的耳聾為語前、雙側、對稱性耳聾，聽力損失程度變異較大，可由輕度到極重度，但多數為重度或極重度耳聾，GJB2基因和先天性聾有著密切關係，中國先天性聾患者中攜帶有GJB2基因突變的約佔20%。GJB2基因突變位點有很多，在亞洲人種中最常見的為235delC，在已完成的1680例非症候群性耳聾患者GJB2 235delc突變的篩查中發現，純合突變148例，雜合突變157例，其中純合突變檢出率為8.81%。雜合突變檢出率為9.35%，總檢出率達18.16%。調查結果表明，GJB2 235delC缺失在中國耳聾入群中佔有相當大的比例。
1.2 線粒體DNA（mtDNA）基因
線敉體基因突變（發生頻率最高的為A1555G突變）與鏈黴素、慶大黴素、卡那黴素等氨基糖甙類藥物引起的藥物性耳聾有著密切關係。在已完成的2016例非症候群性耳聾線粒體DNA 12S rRNA A1555G突變篩查中，發現陽性病例57例，檢出率為2.83%[13]。更為重要的是對其中有完整資料的52個家系的調查顯示，每發現一個陽性患者，平均可以在其家系內發現發現3個耳聾患者，和10個攜帶A1555G突變的正常聽力者，對於這一部分人禁用氨基糖甙類藥物，可以有效避免藥物性耳聾的發生。
1.3 PDS基因
PDS基因又名SLC26A4，在內淋巴管和內淋巴囊、Corti氏器外溝細胞、甲狀腺中高表達，基因突變與弧立的大前庭水管症候群（LVAS）和Pendred氏症候群（前庭水管擴大或伴內耳畸形、神經性聾和甲狀腺腫）有密切關係，臨床上表現為先天性或後天性耳聾，耳聾發生或加重與外傷、感冒有關。對安陽市特教學校151例聾啞學生SLC26A4基因突變熱點區域序列分析結果顯示，31.79%患者檢測到了SLC26A4基因的突變，包括雙等位基因突變者26例（17.22%），單等位基因突變者22例（14.57%）。這3種基因引起的遺傳性耳聾約佔整個遺傳性耳聾的80%。此外，GJB3的突變也能導致常染色體顯性和隱性非症候群性耳聾，被認為與高頻聽力下降有關。該基因也是在我國本土上克隆的第一個遺傳疾病基因，是我國克隆遺傳性疾病基因零的突破。
2. 遺傳性耳聾基因檢測的特徵
耳聾基因檢測為耳科領域出現的新技術、新方法，它具有幾個重要的特徵：（1）基因檢測技術可以對一定比例的耳聾患者進行準確的分子病因分析，而以往非症候群性感音神經性耳聾診斷只能通過病史和排除法推測病因；（2）基因檢測技術可以早於症狀以及常規測聽技術或影像技術發現耳聾易感人群；（3）基因檢測可以作為部分病例常規測聽或影像技術的輔助和補充檢測技術，並實現遠程檢測；（4）基因檢測配合篩查技術和產前診斷可以減少聾病發生、避免聾兒出生。
3. 遺傳性耳聾基因檢測的常規檢測手段
3.1 直接測序：
直接測序（direct sequencing，DS）是將聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增產物純化、變性後，在測序儀上進行測序，為尋找突變的金標準。但其儀器設備昂貴，且操作複雜、耗時較長。此外，雜合突變、膠壓縮、GC富集區的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數據。
3.2 限制酶切指紋-單鏈構象多態性分析（restriction endonuclease fingerprinting-single strand conformation polymorphism，REF-SSCP）：
限制性核酸內切酶切割目標基因的PCR擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測梅切產物，根據異常構象帶進行目標基因有無突變的判斷。該方法最主要的問題是不能檢測到所有的突變，由各實驗室報導的突變檢出率衝99%到35%不等。同時該方法要求多次摸索條件，如電泳溫度，膠中甘油濃度以及膠聯度等均可影響檢測的靈敏度。此外，該方法也不能確定突變的精確位置。
3.3 限制性片段長度多態性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）：
是用特定的限制性內切酶水解目標基因的PCR擴增產物，然後分析酶解產物的電泳圖譜特徵，根據與正常對照的比對結果來判斷待檢樣品是否存在某個基因突變，其弱點操作繁瑣，檢出率低，因為並非所有的基因突變都恰好位於某個內切酶的識別區[16]。
3.4 變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC）：
此技術是一項在單鏈構象多態性分析和變性梯度凝膠電泳基礎上發展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術。它能對大批量PCR擴增產物進行篩查，其在檢測大量致病基因的不同序列方面顯示出高度的敏感性，適合做快速的基因篩查。但它也有一些不盡如人意之處：（1）它只是提供了定性的信息，而無法得出具體的突變類型和突變位點。尚需測序等後續方法證實；（2）其結果判斷通常是由操作者進行的，容易產生觀察差異，不利於各實驗室之間的靈敏度比較；（3）許多片段有多個主要解鏈溫度，需要篩查的溫度較多，增加的工作量。目前該技術主要用來檢測200~300bp大小的DNA片段，長的DNA片段的檢測尚未見報導。
4. 生物晶片的發展概況
生物晶片技術是生命科學研究中繼基因克隆技術及其自動測序技術、PCR技術後的又一次革命性技術突破。
根據晶片上固定探針的不同，生物晶片包括基因晶片、蛋白質晶片、細胞晶片、組織晶片等，如果固定的分子是寡核苷酸探針或DNA，稱為DNA晶片或基因晶片。基因晶片在生物晶片中佔有重要地位，它是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規律地排列固定於支持物上，然後與待測的標記樣品的基因按鹼基配對原理進行雜交，再通過雷射共聚焦螢光檢測系統等對晶片進行掃描，並配以計算機系統對每一探針上的螢光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息[16]。基因晶片技術因其具有微型化、集約化和標準化的特點，在感染性疾病、遺傳性疾病、重症傳染病和惡性腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優勢，可將對應於突變熱點趨的寡核苷酸探針合成點或點加於DNA晶片上，通過一次雜交完成對待測樣品多種突變可能性的篩查，實現對疾病的高效快速診斷。
5. 生物晶片應用於遺傳性耳聾基因檢測
遺傳性耳聾有很高的遺傳異質性，與耳聾相關的基因至少有100個，這給臨床檢測帶來了很大的困難，傳統的基因突變檢測手段費時費力，難以廣泛的開展基因診斷，迫切的需要一種高通量、自動化的核酸序列差異檢測帶來新的曙光，它作為一種高通量、快速、簡便的方法使得多基因、多位點同事檢測成為可能。
Siemering等發表文章指出，應用等位基因特異性寡核苷酸晶片（ASO）對遺傳性耳聾基因進行檢測，檢測結果準確可靠，但應用該方法完成整個檢測需要2d時間；Gardner等和Cremers等相繼報導了晶片微測序方法進行耳聾突變位點檢測的進展，採用該方法完成檢測需要6d，但由於需要四色螢光晶片掃描儀進行檢測，如多重等位基因特異性PCR通用晶片技術（allele-specific PCR-based universal array，ASPUA），該晶片可在5h之內完成導致遺傳性耳聾的4種常見基因（GJB2，GJB3，SLC26A4和線粒體12S rRNA基因）的檢測。
6. 基因檢測對於遺傳性耳聾預防和治療的意義
大多數遺傳性耳聾為感音神經性聾，除了人工耳（cochlear implant，CI）植入外，目前尚無有效治療手段。人工耳蝸價格昂貴，在現階段普及面窄，鑑於遺傳性耳聾治療困難的現狀，因此，以生物晶片為代表的遺傳性耳聾基因檢測技術對於估算發病風險、減小耳聾發病率，具有非常重要的意義。一個已患有遺傳性耳聾的人，可以得到準確診斷並作相應治療；在患者血緣親屬中還沒有達到發病年齡的人，可以通過檢測是否帶有該致病基因，預測將來是否會患病，甚至進行早期幹預治療。例如對於大前庭水管的患者。目前多是在發病後進行高解析度顳骨CT檢查後確診，其預防意義已大為削弱，新生兒大規模的CT掃描在預防醫學中難以實現，而快速簡便的基因檢測則有可能在嬰兒出生後先於CT等影像學檢查發現大部分此類患兒，從而採取嚴格的防護措施。通過基因檢測可以做到早發現，這對於語前聾患者尤為重要，可以儘早利用殘餘聽力佩戴助聽器或植入電子耳蝸，防止患兒變啞，對於語後聾患者，可以部分預測以後發病的風險和發病的年齡階段，從而儘早預防，並對患者的婚配、生育提供遺傳信息。
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