Nature|利用支架引導的類器官晶片構建穩態小腸

類器官，如上皮類器官（如那些源自腸道幹細胞的類器官）在組織和疾病生物學建模方面有很大的潛力。早在2009年，Sato等人證明可以通過單個富含LGR5陽性的小腸幹細胞體外培養成3D上皮樣的小腸類器官。但是，目前用於在3D基質模型中衍生類器官的方法，往往會導致具有封閉的囊性結構的組織隨機發育，這不僅限制了組織的壽命和大小，限制了實驗可操作性，同時體外培養的類器官組織一直無法形成生物體內的血管網絡，而阻礙營養代謝，阻礙組織的生態平衡。但這些缺陷一定程度上可以結合組織工程和精密加工技術得以解決，這就衍生了類器官晶片(organoids-on-a-chip)。

類器官晶片可以廣義地定義為被設計用於在體外模擬人體（或動物）器官功能單元的超微加工的細胞培養設備。該技術結合體外3D培養的類器官，同時融合物理、工程學和微機電、生物醫學、材料學等多個學科的典型交叉前沿科學技術，其中主要核心技術是微流控技術和體外3D培養。

近日，瑞士洛桑聯邦理工學院 (EPFL) 生命科學學院生物工程研究所、基礎科學學院化學科學與工程研究所的Matthias P. Lutolf研究團隊在Nature雜誌上發表了文章 Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis。

該研究團隊開發了一種可滲透氣體、營養物質和大分子的支架，可以誘導腸幹細胞形成管狀上皮，該管狀上皮具有可進入的內腔以及與體內相似的隱窩和絨毛狀結構的空間排列，即迷你腸管。同時，該迷你腸管是可灌注的，從而可以連續去除死細胞，延長組織壽命數周，還可以使腸管定植微生物來模擬宿主-微生物相互作用。迷你腸管還保留了腸道的關鍵生理特徵，並具有顯著的再生能力。

作者首先假設，將囊狀腸器官樣體塑造成其特有隱窩和絨毛結構的形態發生過程，可以用來促進體外幹細胞沿著預定空間邊界模式化分布，特別是那些接近腸道表面三維 (3D) 拓撲的模式化分布。為此，研究團隊製作了一種可滲透氣體、營養物質和大分子的支架，這種支架將促進腸道幹細胞 (ISCs) 的有效粘附、增殖和分化，並且足夠堅硬，可以作為物理屏障，將ISCs的生長限制在預定的形狀。而純基質膠太軟，不能限制小鼠骨髓間充質幹細胞的生長 (LGR5-eGFP+ ISCs) ，作者發現由混合I型膠原和基質凝膠組成的混合基質滿足了這一必要的條件，其中I型膠原提供了相對較硬的粘性基質，基質凝膠包含天然基底膜的關鍵成分。

作者將這些水凝膠整合在一個可灌注的平臺上，形成了一個混合微晶片系統，該系統由一個彈性裝置組成，該裝置具有一個中心腔室，用於裝載水凝膠和隨後的器官樣培養，兩側是一對 (入口和出口) 容器，用於裝載細胞和腔內灌注，以及側向容器，通過水凝膠向組織的基底側提供培養基和生長因子 (圖1a，b)。

微通道包含模擬小鼠小腸中天然隱窩幾何形狀的微腔，在中心凝膠支架內進行雷射消融 (圖1b)。這些管狀水凝膠支架可以通過從入口容器，輕鬆地將小鼠LGR5-eGFP+ ISCs灌注並定植進去。這些快速建立的融合細胞陣列比3D基質凝膠中生長的組織大幾倍。同時，這些組織保持開放，兩端沒有細胞，使液體能夠輸送到上皮的頂端，並可以從管腔中除去不粘附或死亡的細胞。

圖1. 迷你腸道培養的3D水凝膠微設備

事實上，在常規器官樣細胞的封閉腔中，高水平的細胞脫落和死亡細胞的積累導致約10天後的組織破壞。如果想要實現傳統上皮類器官的無限增殖，需要採用連續傳代的方法，工序複雜。而作者則建立了不需要傳代的、細胞生長和死亡平衡的長壽穩態器官樣培養系統——通過灌注從快速生長的上皮細胞中連續去除死亡細胞的方式——實現了保持管狀腸上皮數周的可能性。當每12小時灌注管腔以從器官樣管中去除死亡細胞時，組織的壽命可以延長到一個月或更長，進而保持LGR5-eGFP+ ISCs的整體組織解剖和局部環境。

作者接下來測試了分化的誘導將如何影響ISC衍生的迷你腸管中細胞的命運。結果顯示，迷你腸管的細胞類型的仿生空間分布（圖2a-f）類似於體內沿隱窩絨毛軸的細胞命運模式。其中，隱窩樣區域僅包含SOX9染色陽性的細胞（圖2a）和Paneth細胞 (圖2b)。分裂細胞 (EdU) 的區域在很大程度上局限於隱窩區域（圖2c）。

相反，腸細胞標記物陽性的細胞（圖2d），腸內分泌細胞（圖2e）和杯狀細胞（圖2f）幾乎只存在於管的中心區域，對應於絨毛樣區域。這些數據表明，空間封閉的水凝膠支架促進了腸上皮細胞的「導向」自組織形成功能性腸管，該功能性迷你腸管顯示出與體內天然小腸相似的隱窩和絨毛樣區域的空間排列。

圖2. 迷你腸管的細胞命運模式分布。

那麼迷你腸管中細胞多樣性和不同細胞類型的比例如何呢？作者對從幼 (10天) 和老 (20天) 的小腸管中分離的細胞以及混合的基質凝膠衍生的器官樣細胞進行了單細胞RNA測序 (scRNA-seq)分析。作者在迷你腸管中發現了傳統類器官中沒有發現的，表達腸絨毛末端細胞標記的細胞和M樣細胞。

值得注意的是，腸內分泌細胞在穩態迷你腸管中相對豐富 (約5%) ，該比例類似於在體內發現的細胞比例，但是這些細胞在傳統的類器官中非常罕見 (約0.3%) 。總的來說，這些數據顯示，研究團隊開發的類器官晶片培養的迷你腸管中的細胞類型與體內細胞類型的多樣性非常相似，包括在傳統類器官中罕見或缺失的細胞類型。隨後作者通過三種上皮損傷模型發現，迷你腸管具有顯著的損傷後再生潛力。

我們知道人體腸道裡面富含各種微生物，那麼迷你腸管是否能夠模擬微生物-宿主相互作用呢？作者採用了隱孢子蟲感染模型來解密。隱孢子蟲是一種專性寄生蟲，在免疫功能低下的成年宿主和嬰兒中會導致危及生命的腹瀉。通過用新分離的子孢子感染迷你腸管並每天分析，作者觀察到新形成的隱孢子蟲卵囊連續產生了至少四周。因此，迷你腸管非常適合用於宿主-微生物相互作用機制和長期感染研究。

總結，通過將生物工程與幹細胞的自組織特性相結合，作者研發了開放的管狀「類器官晶片」，它們顯示出卓越的細胞類型多樣性、組織結構和功能。而微晶片灌注系統的引入使得從管腔中有效去除脫落/死細胞並將其暴露於寄生蟲或培養基添加劑成為可能。

通過調整水凝膠支架的特定特性（例如，它們的組成、幾何形狀、大小、硬度和信號輸入），他們研發的新技術可以應用於其他器官樣幹細胞，包括那些來自其他器官（如肺、肝或胰腺）和來自患者活檢的幹細胞。這一容易製備的3D組織解剖模型，允許在高度易處理的實驗框架中促進幹細胞的發展，並可能在藥物研發、診斷和再生醫學方面具有巨大的潛力。