時間：2019-04-10 18：30—20：00
地點：A5教學室
參加人員：夏中穎、楊二鵬、楊嘉欣、何亞琳、孫適然、徐楠、袁淳晟、馬慧淼、孫小梅、王佳聰、王玉坤
記錄人員：何亞琳
報告人員：徐楠
一、內 容
主要從以下幾部分講行講述：
① 微衛星不穩定（MSI）的含義；
② 錯配修復（MMR）與MSI；
③ MSI與結直腸癌 ；
④ MSI與其他腫瘤；
⑤ 免疫治療與MSI。
（1）微衛星不穩定（MSI）的含義：
談到微衛星不穩定（MSI），我們首先了解一下什麼是微衛星（MS）。
微衛星（MS）又稱簡單重複序列（SSR），在真核生物廣泛存在，是短而重複的DNA序列，由1-6個核苷酸組成，常見類型為雙鹼基CA／GA或單鹼基A／T等。它存在於內含子等非編碼區，多態性分布於整個基因組，個體差異大。
與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛星的重複單位沒有插入或缺失的改變，該微衛星是穩定的狀態，我們稱之為微衛星穩定（MSS）。
由此我們可知，微衛星不穩定是在DNA複製時插入或缺失突變引起的MS序列長度改變的現象，常由錯配修復(MMR)功能缺陷引起。1993年被Jacobs等人在結直腸癌中首次發現，與癌症發生有關，可用於癌症檢測。
微衛星狀態可以分為：
微衛星穩定（MSS）
高度微衛星不穩定（MSI-H）
中度微衛星不穩定（MSI-M）
低度微衛星不穩定（MSI-L）。
（2）錯配修復（MMR）與MSI
DNA修複方式有：直接修復、核苷酸切除修復、鹼基切除修復、錯配修復、重組修復。
某些修複方式有缺陷，可導致一些疾病產生。例如著色性幹皮病，是由於核苷酸切除修復缺陷，導致皮膚癌風險顯著增加；重組修複方式缺陷，引起共濟失調毛細血管擴張症——ATM酶突變，對X射線敏感，淋巴瘤風險增加。BRCA1/2突變：乳腺癌、卵巢癌風險增加。
錯配修復（MMR）是重要的DNA修復機制，是識別及修復在DNA複製或重組過程中，可能產生的鹼基的錯誤插入、缺失和錯配，以及修復某些形式的DNA損傷的系統。
在人體內，7個MMR蛋白(MLH1, MLH3,MSH2, MSH3, MSH6, PMS1和PMS2)按照工作順序進行DNA的修復；除此之外，MMR輔路上還有Exo-1依賴性蛋白和Exo-1非依賴性蛋白。
錯配修復又可分為錯配修復缺陷和錯配修復完整。
錯配修復缺陷（dMMR）：MMR缺陷，即DNA錯配修復功能缺陷，MMR蛋白表達陰性；MMR功能缺陷與多種腫瘤相關，尤其是遺傳性非息肉性大腸癌(Lynch症候群)、部分散發性大腸癌。
錯配修復完整（pMMR）：MMR完整，即DNA錯配修復功能正常，MMR蛋白表達陽性。
MMR作用流程：
①MMR基因識別出正確的DNA鏈；
②MMR基因切除掉不正確的核苷酸片段；
③通過DNA聚合酶III和DNA連接酶的作用，合成正確配對的雙鏈DNA；
④DNA聚合酶打滑：模板鏈/新生鏈有時會發生鹼基的「還出」現象，引起一個或數個鹼基的插入或缺失，屬於自發性DNA損傷。
（DNA聚合酶易在模板上有幾個相同鹼基串聯（微衛星）的部位打滑，聚合酶在模板鏈上的滑移易於造成缺失，在生長鏈上的滑移易於造成插入。）
MSI的檢測：
MSI常由MMR基因突變及功能缺失導致。
因此，在檢測癌細胞中MSI時，既可以直接檢測MSI序列變化，也可以通過檢測MMR基因缺失來確定是否發生MSI。
兩種檢測一致性很好，MSI檢測發現的結直腸癌中近93%也適用於MMR基因缺陷檢測。
目前有兩種檢測技術：MMR基因缺陷檢測常依賴於免疫組化/IHC（蛋白水平）；MSI檢測一般依賴於分子手段，聚合酶鏈式反應/PCR(DNA水平)。
目前常用的檢測MSI的方法是分子檢測結合免疫組化檢測。
IHC檢測的優勢是可以直接鑑定出導致MSI發生的MMR缺陷基因，但是，約5%-11%的MSI發生並不會出現MMR蛋白的缺陷。某些MMR蛋白錯義突變（指可導致多肽產物的胺基酸序列改變或功能性RNA鹼基序列改變的鹼基替換突變。這種突變可能對表達產物沒有影響，也可能帶來好處，但多數情況帶來有害或致死效應），會損失MMR功能，但能被抗體檢測識別，因此這是分子檢測的優勢。
4個蛋白表達的意義
此外還有基因測序（NGS）
基因位點（5個位點）
基因位點（大於5個位點）
MMR狀態
微衛星狀態
0
0
MMR完整
MSS/MSI-L
1
<30%-40%
MMR缺陷
MSI-L/M
≥2
≥30%-40%
MMR缺陷
MSI-H
（3）MSI與結直腸癌（CRC）
①散發性結直腸癌：
佔CRCs的12%。常由MLH1啟動子區域高DNA甲基化（CIMP）造成MMR功能缺陷引起MSI。易發生在無明顯家族遺傳史的老齡化個體中，MMR缺陷直接發生在結直腸癌體細胞中。
②遺傳非息肉病性結直腸癌（HNPCC）：
佔CRCs的3%，又稱Lynch綜合症。家族遺傳性疾病，由於生殖細胞中攜帶有MMR基因突變，因而MMR功能易缺陷導致MSI結直腸癌出現。常見Lynch綜合症患者中MMR基因突變位點易發生在四個相關基因中：MLH1，MSH2，MSH6，PMS2。主要是MLH1和 MSH2。
隨著時間推移，高風險發生癌症：結直腸癌，子宮內膜癌，卵巢癌，胃癌，小腸癌，肝膽癌，上泌尿道癌，腦癌，皮膚癌。
③根據NCCN指南指出：MSI檢測應在所有結直腸癌史的病人中進行。MSI檢測可作結直腸癌預後良好的標誌。診斷Lynch綜合症時應排除同時存在MLH1缺陷與BRAF(V600E)突變的病例。（1、BRAF突變與MLH1啟動子甲基化有很強的相關性。
2、BRAF突變機會都發生在一個位點上V600E-95%；3、BRAF突變一般發生在散發性結直腸癌患者中，不發生在林奇症候群患者中；4、若MLH1啟動子甲基化，則該MLH1蛋白不或者低表達，免疫組化呈現的結果就是MLH1蛋白表達丟失）
MSI-H的結直腸癌II期病人有較好的預後，但不能在5-FU治療中獲益。（III-IV期呢？不影響），（其他化療藥/靶向藥呢？對奧沙利鉑似乎不受影響，伊利替康：dMMR更敏感/不明確；貝伐單抗？可獲益/不明確）。
④關於預後：
與DNA修復功能正常的患者相比，MMR功能缺陷的患者的腫瘤具有復發率低、緩解期長、低轉移和存活率較高等特點。MMR缺陷患者預後相對較好。（轉移後呢？和pMMR無明顯差別）
Lynch綜合症
Lynch綜合症患者生殖細胞（生殖/表觀遺傳）中積累MMR基因突變，包括MLH1，MSH2等，可遺傳給後代。
偶發性MSI結直腸癌中，常為MLH1基因啟動子區域富含DNA甲基化，抑制其表達而造成MMR缺陷，導致MSI；
Lynch綜合癥結直腸癌患者具有MSI特徵，家族遺傳性疾病。後代患結直腸癌年齡較早，癌細胞內常會累積KRAS基因突變；
約一半的偶發性MSI結直腸癌會累積BRAF(V600E)突變，但一般不會發生在Lynch綜合症引起結直腸癌患者中。
BRAF(V600E)突變對MSS與MSI-H結直腸癌患者術後的預後影響
MSS患者中BRAF突變明顯影響預後；
MSI-H患者BRAF突變與預後無關；
KRAS或BRAF突變MSI CRC和MSS CRC相比，前者的DFS 和OS更優；
轉移性MSI CRC存在BRAF突變時生存較差；
無KRAS和BRAF突變的III期MSS CRC與MSI CRC 經FOLFOX治療後DFS相似；
因此有必要對MSI CRC採用分子標誌進行亞分層。
2009年Jerusalem標準對於診斷LS的建議：
步驟1
腫瘤MSI檢測（可選擇IHC法測MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）
步驟2
MLH1異常，進行BRAF V600E突變和MLH1啟動子過甲基化檢查一區分散發和LS相關CRC，先做BRAF V600E突變檢測；（此時若腫瘤缺少MSH2、MSH6和PMS2，遺傳學胚系DNA檢查證實LS）
步驟3
如果BRAF V600E突變陰性，則進行MLH1啟動子過甲基化檢查
步驟4
若MLH1啟動子過甲基化陰性，通過遺傳學胚系DNA檢查證實LS
（4）MSI與其他腫瘤
近20多年的研究發現，MSI普遍存在於其他癌症類型患者中，其中包括子宮內膜癌，胃癌，肝細胞癌，黑色素瘤等癌細胞中。
Ronald J Hause等人利用基因組全外顯子測序技術，分析了18種癌症5930個基因組，發現其中14種癌症患者癌細胞中發生MSI，其中子宮內膜癌MSI頻率最高為30%，其次是胃癌與結腸癌，均為19%。
（5）免疫治療與MSI
在直腸癌NCCN（2017年）指南中，有指出當患者不適宜高強度化療時，可使用Nivolumab或Pembrolizumab，但是只適用於dMMR/MSI-H
免疫治療機理
與免疫治療相關的標誌物
在患者的免疫抑制劑療效評估結果匯總中指出，通過檢測腫瘤突變負荷（TMB）、微衛星分析（MSI）、PD-L1蛋白表達水平，可找出可能獲益的臨床藥物。
① 腫瘤細胞的體細胞突變負荷(TMB):
指外顯子區域上平均1Mb鹼基出現的體細胞突變（非同義突變）。
有臨床證據表明，具有高水平TMB的腫瘤細胞更容易被免疫系統識別，更可能對免疫檢查點抑制劑有治療效應；
TMB是篩選PD-1/PD-L1抑制劑的治療獲益人群的生物標誌物之一；
TMB可潛在甄別具體的突變模式和推測新抗原負荷。
腫瘤新抗原負荷（TNB）
與腫瘤突變數量直接相關的腫瘤突變負荷（TMB）會是一個重要的標誌物。而如果進一步對突變進行區分，考慮一個突變是不是能夠產生足夠合適的新抗原，即腫瘤新抗原負荷（Tumor Neo-antigen Burden, TNB）。
HLA的多樣性可以是一個標誌物之一。
PD-L1表達可以是標誌物之一。
腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的豐度也可以是標誌物之一。
具有dMMR的腫瘤患者可能會比pMMR的腫瘤患者具有更多的突變，所以dMMR也是一個相關標誌物。
MSI可以側面反應MMR系統是否工作良好,它可以作為一個重要的相關標誌物。
不同標誌物之間的關係
免疫檢查點抑制劑標誌物
免疫治療與MSI
MMR基因的突變不但和TMB以及新抗原有關係，實際上和PD-L1的表達以及淋巴細胞的浸潤也非常有關係，它與PD-L1表達量以及TIL的關聯性強度甚至大於腫瘤的類型。
免疫治療與MSI
臨床研究表明，Nivolumab聯合Ipilimumab顯著延長dMMR/MSI-H、轉移性結直腸癌患者的客觀緩解率。
小結：通過詳細講解了微衛星不穩定、錯配修復等相關知識，讓我們了解到微衛星不穩定在臨床中與某些腫瘤發生及治療密切相關，指導每一位醫務人員在面對結直腸癌患者時應考慮檢測哪些指標？選擇何種方式為最佳治療？
程老師總結：
首先徐楠講的這個主題是目前為止我聽到的錯配修復基因這方面講得最好的一個。其實我們曾經也辦過一場講座，但是講得沒有這麼細。
今天講的內容涉及到了什麼呢？其實涉及到了「精準醫學」，所謂「精準醫學」就是把這個病人分得越來越細。同樣是結直腸癌，但因為它的基因分型不同，採取的治療方法不同、預後也不同。今天為什麼要講這個東西呢？關鍵還是要指導我們臨床，離開臨床就任何意義也沒有了。作為常規檢測，手術後結直腸的病人一定要做MMR（錯配修復基因）。
現在消化道的其它腫瘤也開始要做MMR了，包括剛才說的免疫治療。到底是微衛星穩定還是不穩定？也就是說，不論哪種腫瘤只要是微衛星高度不穩定（dMMR/MSI-H）,不管PD-L1受體表達與否，就可以用免疫治療，這在中醫裡頭叫「同病異治，異病同治」，現在西醫也採用了。
我們有三項針對患者免疫抑制劑療效評估：腫瘤突變負荷（TMB）、微衛星分析、PD-L1蛋白表達水平檢測，這三個碰上一個，都是可以用PD-1抑制劑的。dMMR/MSI-H它與結直腸的關係是最大的，大家有的時候看到病理報告的時候，一般那四項（指MLH1,MSH2, MSH6,PMS2四項）是經常能看到的，幾乎80%-90%的病人都是+，+到++++（指MLH1,MSH2, MSH6,PMS2四項都是+），同時出現，一看就是微衛星穩定的(pMMR/MSS)。
那麼這個在臨床上如何去指導我們呢？比如說我們在臨床上看到四個加號的病人，還要看他的分期，如果這個病人是I期的，那就根本不用去管他，穩定不穩定都沒有關係。
II期爭論就比較大，到底這個病人是打化療還是不打化療，就要看他的微衛星穩定還是不穩定。如果這個II期的病人微衛星穩定的話，就打化療，不穩定的話，就可以不用。
再一個就是看II期有沒有高危因素，高危因素有哪些大家知道嗎？神經侵犯、脈管癌栓、有沒有術前腸梗阻、CEA是否高、有沒有穿孔、切除淋巴少於12等，這都是II期的高危因素。（II期結腸癌高危因素主要包括：①術後病理提示腫瘤為未分化或低分化；②腫瘤有脈管浸潤（包括血管和淋巴管）；③術前患者合併有腸梗阻；④病理活檢的淋巴結數目少於12枚；⑤神經周圍有浸潤；⑥腫瘤局部有穿孔；⑦切緣臨近腫瘤組織或腫瘤切緣不確定是否陽性或切緣肯定陽性。）微衛星穩定的情況下有II期的高危因素是要打化療的。
所以說在臨床上你要有這麼一個概念，錯配修復基因缺失的是微衛星不穩定（dMMR/MSI），無缺失的是微衛星穩定(pMMR/MSS)，它是互相對應的，如果是微衛星不穩定的話，還得再測一個確定它是否為林奇症候群(Lynch綜合症)，光靠那幾個是不能定下來的。（在《NCCN指南》和《遺傳性結直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識（2018）》中均建議：林奇症候群的基因檢測應包括MMR基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）和EPCAM基因。EPCAM基因又稱上皮細胞黏附分子基因，其3'端位於MSH2基因的上遊，故其缺失會導致MSH2啟動子甲基化，進而使MSH2被沉默，是導致LS發生的另一個重要病因。EPCAM基因3'端缺失和MLH1或者MSH2突變所致的LS患者發展成結直腸癌的概率相當。EPCAM缺失終生患結直腸癌的風險為75%。）
通過今天的學習，與我們臨床最密切的就是這個：II期病人是不是要化療，再一個看他的預後，再一個是否適合免疫治療，這就給了我們三個信息，剛才已經說得很清楚了，II期的話，比如說這個病人是高微衛星不穩定，它的預後是好的，對5-Fu是不敏感的，化療可以不做。國外曾經做過一個臨床試驗，得出的結論是高微衛星不穩定II期患者使用5-Fu的受益率只有3%-4%，不足5%，而且做了化療的患者復發的概率更高。另外，碰到高微衛星不穩定的患者，你再看下是不是Lynch症候群……。