微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）是指由於錯配修復（mismatch repair，MMR）蛋白缺失（deficient MMR，dMMR）導致微衛星序列（通常由1-6個核苷酸為單位的串聯重複DNA序列）複製錯誤不能被修復，當錯誤累積到一定程度即形成微衛星高度不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）。目前在結直腸癌（colorectal cancer，CRC）診療中已常規開展微衛星穩定性檢測，但其對CRC的臨床指導意義部分尚存在爭議。以下我們將提出並回答十個結直腸癌與微衛星不穩定的臨床問題，以期能引發一些思考並提供臨床參考建議。
目前越來越多的證據顯示無論家族史和發病年齡，對CRC患者進行林奇綜合症（Lynch Syndrome，LS）的篩查有助於發現更多的LS患者，而MSI/MMR檢測是篩查的重要手段；對於II期CRC預後、高危II期輔助治療的選擇，以及IV期CRC免疫治療均有明確的指導作用。雖然微衛星狀態對III期CRC的價值尚存在爭議，但氟尿嘧啶單藥輔助化療不獲益的結論對不能耐受含鉑方案的患者仍有重要提示價值。因此，美國NCCN指南及美國胃腸病協會均建議對所有CRC無論年齡及分期，都應該進行MSI/MMR檢測。
目前檢測微衛星狀態的方法主要有三種，包括免疫組化（immunohistochemistry，IHC）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）以及二代測序（next-generation sequence，NGS）。
（1） PCR
採用PCR方法比較腫瘤組織和正常組織DNA中重複核苷酸序列長度是最早確立檢測CRC微衛星狀態的分子手段，也是MSI檢測的金標準。目前最常用的Bethesda標準由2個單核苷酸重複序列（BAT-25和BAT-26）和3種二核苷酸重複序列（D5S346，D2S123和D17S250）構成。就Bethesda標準而言，五個位點中出現2個或以上的不穩定（Pentaplex panel出現3個及以上或更大panel中存在≥30%的重複不穩定序列）為MSI-H，存在1個位點（或更大panel中10-30%的重複不穩定序列）為微衛星低度不穩定（microsatellite instability-low，MSI-L），而無不穩定位點（或更大panel中＜10%重複序列）則為微衛星穩定（microsatellite stability，MSS）。
既往研究表明MSI-L與MSS腫瘤生物學特點沒有明顯的差異，所以臨床中通常將MSI-L與MSS歸為一組微衛星穩定。雖然PCR是「金標準」，但由於不能提供準確的突變基因、實驗周期較長等特點一定程度上限制了其臨床的使用。
（2）IHC
免疫組化以其簡便快捷的優勢成為目前最常用的檢測方式，通過使用相應抗體檢測四種常見錯配修復基因（MLH1，MSH2，MSH6和PMS2）在細胞核內表達的情況，明確是否存在錯配修復功能缺陷。存在1種或以上蛋白表達陰性即為dMMR，相當於MSI-H；否則為錯配修復蛋白完整（proficient MMR，pMMR），相當於MSI-L/MSS。
IHC檢測的MMR經過嚴格質控後可以達到與PCR檢測90-95%以上的一致率。另約有5-11%的MSI-H CRC其四個錯配修復蛋白可以完整表達，其原因包括錯配修復基因一些少見的錯義突變(多為MLH1和MSH6基因）雖然影響其蛋白功能，而蛋白翻譯和抗原性正常，仍能被抗體所識別，IHC檢測實為「假陽性」；此外，由於錯配修復系統的蛋白存在功能重疊（PMS2和PMS1、MSH6和MSH3），因此雖然蛋白表達缺失，IHC表現為dMMR，而PCR卻顯示MSS。免疫組化檢測本身也存在主觀性，且受檢測抗體質量、檢測過程（固定、染色）等因素影響，導致各中心的檢測準確率高低不一。
（3）NGS
隨著高通量測序技術在腫瘤領域的深入發展，NGS也開始應用於MSI檢測。對於CRC而言，同時進行MSI和RAS、RAF等靶向基因檢測可以減少組織樣本需求量。此外，檢測腫瘤突變負荷（tumor mutation burden, TMB）、胚系基因，並發現PCR不能測出的體細胞雜合性缺失突變以及其他基因結構突變導致dMMR，也是NGS的優勢。
目前基於NGS檢測MSI狀態主要有兩種方式，其一是通過全外顯子測序檢測TMB估測MSI狀態，TMB高與MSI-H顯著相關。另一種方式是通過選擇一組位點的reads數目分布直接評估微衛星不穩定的程度(MSIsensor、mSINGS)。上述方法都證實了其對MSI狀態評估的準確性，甚至部分方法經過了免疫治療臨床試驗的驗證。來自浙江大學一項研究業已證實，相較於傳統PCR檢測，NGS-MSI（MSI-ColonCore）一致性高達99%。但目前NGS檢測MSI尚缺乏統一的標準，對檢測平臺的儀器、技術和生信分析能力有著更高的要求，昂貴的測序費用也是臨床醫生必須考慮的問題。
因此，三種檢測方法從臨床需求來說，我們通常首選IHC或PCR檢測；如果某些患者IHC或PCR檢測提示為pMMR/MSS，但具有發病年齡早（小於50歲）、強烈的腫瘤家族史、右半黏液腺/印戒細胞癌、對常規化療原發耐藥等特殊情況，可考慮行NGS覆核其微衛星狀態避免漏診。
雖然MSI被認為是CRC發生的早期事件，異質性小，但MSI作為免疫治療療效的預測指標，對帕博麗珠單抗和納武利尤單抗的客觀緩解率（objective response rate, ORR）通常小於50%（28-52%），反映了該類腫瘤確實存在異質性可能。目前已有CRC中原發灶腫瘤內MSI異質性的個案報導，但似乎對免疫治療沒有明顯影響，該結論可能還需大樣本研究進一步證實。
原發灶和轉移灶MSI的異質性數據也比較有限，大部分小樣本研究均得到在肝、肺、遠處淋巴結的轉移灶與原發灶較一致率較高（92-100%），而腹膜及卵巢與原發灶一致率較低（75-78%、0%，分別）。但另一項回顧性分析40例腸癌肝轉移標本，原發灶與肝轉移灶一致率為85%（34/40）。2018年ASCO公布的一項研究顯示，331例CRC患者，23例dMMR原發灶患者中26.1%轉移灶檢出pMMR，而308例pMMR原發灶中，3.6%轉移灶檢出dMMR，研究認為CRC原發灶與轉移灶MMR狀態存在差異。
總體來說，原發灶瘤內和原發灶與轉移灶的MSI一致性比較高，通常對一處進行微衛星狀態評估即可。但對於術後較長時間後才復發轉移或經過多線多療程治療後的患者，如果情況允許，也可考慮再次活檢評估微衛星狀態。
通過NGS檢測外周血循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）的MSI（MSI from blood, bMSI）已逐漸嶄露頭角，這為晚期腫瘤患者標本取材困難或不足提供了新的解決辦法。在一項大樣本（n=1145，近800例為CRC）對比循環DNA與組織DNA檢測MSI的研究中，相較於組織MSI，bMSI達到98.4%的一致率和95%的準確率。另一個2019年在ASCO-GI公布的bMSISEA方法（NGS）通過ctDNA檢測了87例CRC樣本（43例MSI-H和44例MSS），當血漿ctDNA含量>0.4%時，檢測靈敏度可達94.1%，準確性達97.7%；當血漿ctDNA含量>1%時，準確性可達到100%。此外，由北京腫瘤醫院消化內科沈琳教授牽頭的bMSI在以消化系統為主的多中心臨床療效驗證隊列研究（IMPACT研究）業已進入數據分析階段，結果值得期待。因此，對於腫瘤負荷大，ctDNA含量較高，而組織標本取材困難時，液體活檢檢測可考慮作為一種替代方法。
高危II期MSI-H/dMMR結直腸癌是否應該行輔助化療？
II期CRC中，MSI-H/dMMR發生率約15%，是明確的獨立良好預後指標；氟尿嘧啶單藥在II期MSI-H/dMMR輔助化療不能獲益。無高危因素的II期MSI-H/dMMR CRC建議觀察，但對於高危II期CRC輔助化療，MSI-H/dMMR預測作用仍存在爭議。
一項結腸癌大樣本MSI-H/dMMR研究（n=433）亞組分析顯示高危II期的MSI-H/dMMR患者（n=149），氟尿嘧啶聯合奧沙利鉑相較於單純手術治療有提高無疾病生存期（disease-free survival，DFS）的趨勢（HR=0.13，P=0.06），而氟尿嘧啶與單純手術治療比較無顯著DFS差異（HR=0.85， P=0.83）。另一項基於公共資料庫的II期結腸癌（n=3851）回顧性分析同樣證實在具有高危因素的MSI-H/dMMR患者（n=1906）中，無論單藥（HR 0.38，P=0.006）或聯合化療(HR 0.58，P=0.02)，均能延長總生存時間（overall survival，OS）。但也有研究認為即使在復發風險最高的pT4組中，MSI-H/dMMR患者單純手術、單藥及聯合化療對預後無顯著性差異（P=0.691）。鑑於II期MSI-H/dMMR輔助治療的數據多來自於回顧性研究的亞組分析，且樣本量有限，仍需要前瞻性研究進一步證實。目前NCCN指南建議高危II期MSI-H/dMMR單純觀察,而CSCO指南建議行聯合化療。
總的來說，在免疫輔助治療時代來臨前，根據現有證據我們強烈推薦對高危II期MSI-H/dMMR患者進行個體化的治療決策。對於老年、體質偏弱或擔心化療相關不良反應的患者，可以選擇定期觀察隨訪；而對於包含多個高危因素、相對年輕且治療積極的患者，在充分溝通獲益和風險後，我們傾向可以考慮行3個月聯合方案輔助化療。
MSI/MMR狀態對III期結直腸癌有預後及治療指導作用嗎？
III期CRC中，MSI-H/dMMR約佔10%，這一分期患者微衛星狀態的預後及預測作用均存在爭議。部分研究認為III期MSI-H/dMMR仍是預後良好的因素，也有數據顯示MMR狀態在III期結腸癌中與預後無關。結合CRC的異質性，單一的標誌物較難準確判斷預後。近年來提出的以II-III期結腸癌為基礎的結直腸癌共識分子分型（consensus molecular subtype，CMS）評分，其中MSI-H、BRAF突變等被歸類於CMS1型（免疫型），該型在III期CRC中預後較其他亞型更好。但MSI和BRAF對於III期CRC與預後所佔權重仍無定論，就目前的證據來說，在接受FOLFOX方案輔助化療的患者中，MSS/BRAF突變型預後最差，MSI-H/BRAF野生型預後相對更好，而MSI-H/BRAF突變和MSS/BRAF野生型預後居中。此外，KRAS和左右半因素也應納入協助判斷。同時，2019年ESMO報導的一項研究顯示術後ctDNA監測可以識別III期腸癌高復發人群，綜合多個因素的預測模型或許是未來預後、預測療效探索方向。
就其預測作用而言，大部分研究支持氟尿嘧啶單藥對MSI-H/dMMR結腸癌輔助治療不獲益的結論同樣適用於III期的患者。而奧沙利鉑在錯配修復蛋白缺失情況下不影響其與DNA形成的螯合物發揮抗腫瘤作用。目前幾個大型輔助治療研究的匯總分析均顯示在接受奧沙利鉑為基礎的聯合方案輔助化療的III期CRC中，MSI-H/dMMR仍是一個預後良好的因素，且結合MSI-H/dMMR III期患者3年內仍有近30-50%復發的可能性，因此目前仍建議這部分患者行術後標準的聯合輔助化療。
輔助免疫治療儘管沒有證據，目前正在進行的一項III期隨機對照研究（NCT02912559），擬入組700例III期MSI-H/dMMR結腸癌，試驗組接受6個月FOLFOX聯合Atezolizumab後使用Atezolizumab維持6個月，以DFS作為主要終點，該項研究預計在2020年12月完成。對於局部分期非常晚的MSI-H/dMMR CRC患者（尤其是ctDNA陽性）是否是輔助免疫治療最能獲益的人群，我們期待其結果的公布。
MSI-H/dMMR結直腸癌是否應該行新輔助免疫治療？
對於新輔助治療領域，FOxTROT研究對結腸癌患者進行6周FOLFOX±帕尼單抗新輔助化療，術後病理顯示dMMR患者腫瘤退縮反應明顯差於pMMR患者（P<0.001），因此不推薦常規行新輔助化療，但腫瘤最大程度退縮的時間、最佳化療周期以及對dMMR合適的化療藥物需要進一步探索。此外，NICHE研究使用Nivolumab（3mg/kg，d1，d15）聯合小劑量Ipilimumab（1mg/kg，d1）作為新輔助方案治療I-III期結腸癌的初步結果顯示，患者在治療後6周內接受手術，其中dMMR患者（n=7），57%（4/7）達到病理完全緩解，餘下患者（3/7）殘留癌細胞比例均≤2%。該項研究結果為新輔助免疫治療提供了證據，但是否能轉化為生存獲益還需等待下一步的研究數據。同時，免疫治療的不良反應也是是否行新輔助免疫治療必須考量的因素。雖然免疫治療單藥3級以上不良反應發生率多<3%，致死性不良反應概率也較低（0.3-1.3%），但雙免疫治療時不良反應會明顯增加。考慮到可切除MSI-H/dMMR CRC整體預後較好，是否還需行新輔助免疫治療一定要慎重評估。
因此，我們推薦在多學科指導下，對於局部分期晚（如T4b）、腫瘤負荷大且需要聯合臟器切除或者中低位直腸癌涉及保肛或肛周切緣陽性問題的MSI-H/dMMR患者，可以考慮嘗試新輔助免疫單藥治療甚至聯合免疫治療。
MSI/MMR狀態對IV期結直腸癌有預後及治療指導作用嗎？
（1）預後評估
在轉移性結直腸癌（metastatic CRC，mCRC）中，MSI-H/dMMR被認為可能是預後不良的指標，免疫檢查點（PD-1、PD-L1、CTLA-4等）的表達抵消了免疫浸潤對生存的積極影響可能是潛在的機制。但該結論也仍然存在爭議，如CALGB/SWOG 80405研究認為，MSI-H/dMMR並不是IV期CRC的不良預後因素。
（2）化療療效預測意義
兩個早期小樣本研究認為5-FU對mCRC治療有效，但該結論並未得到後續研究的支持。一個多中心回顧性分析得到MSI-H/dMMR mCRC接受一線氟尿嘧啶單藥有效率僅14%，因此5-FU對MSI-H/dMMR的mCRC可能是療效不佳的。奧沙利鉑與伊立替康對MSI-H/dMMR mCRC的療效是目前另一個爭議點。伊立替康為基礎方案一線治療MSI-H/dMMR mCRC回顧性研究亞組分析顯示，患者反應率為72%；而奧沙利鉑為基礎的治療反應率僅22-33%。由於數據來自於不同研究的亞組分析，病例數有限，可比性較差。但如前文所述FOxTROT研究顯示FOLFOX方案新輔助化療的dMMR患者術後病理腫瘤退縮反應明顯差於pMMR患者，因此該結果提示dMMR患者對奧沙利鉑治療反應相對不敏感。另外，一項多中心回顧性研究納入284例MSI-H/dMMR CRC患者，FU為基礎、奧沙利鉑為基礎以及伊立替康為基礎的方案並未顯示出對中位PFS（3.9月、4.4月和3.0月，P=0.20）和OS（17.9月、16.8月和23.9月，P=0.14）的統計學差異，但似乎伊立替康相對更有優勢。
（3）靶向治療療效預測意義
就靶向治療而言，目前mCRC批准使用的表皮因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）抑制劑和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抑制劑，據研究顯示：MSI-H/dMMR腫瘤啟動子甲基化引起EGFR配體減少，使EGFR抑制劑療效降低；貝伐珠單抗可以通過抑制血管生成、血管正常化減少免疫抑制細胞，增強免疫反應，故貝伐珠單抗療效可能優於西妥昔單抗。CALGB/SWOG 80405研究一線FOLFOX聯合貝伐珠單抗或西妥昔單抗治療mCRC，分析顯示MSI-H/dMMR亞組中FOLFOX聯合貝伐珠單抗優於聯合西妥昔單抗（中位OS 30個月 vs 11.9個月），印證了上述結論。此外，雖然靶向藥物在輔助治療研究中為陰性結果，NASBP C-08研究亞組分析得到II-III期CRC MSI-H患者FOLFOX+貝伐珠單抗優於化療組。有限的研究的亞組分析顯示VEGF抑制劑對MSI-H/dMMR腫瘤可能有一定應用前景。
（4）免疫治療療效預測意義
MSI-H/dMMR是包括CRC在內的泛瘤種免疫治療療效預測指標。在KEYNOTE-158納入27種非CRC的不同部位腫瘤使用帕博麗珠單抗治療分析得到，子宮內膜癌療效最佳（ORR 57.1%，中位PFS 25.7個月），胰腺相對較差（ORR 18.2%，中位PFS 2.1個月），而顱內腫瘤對免疫治療基本沒有反應。同時，單CRC腫瘤對免疫治療也存在療效差異，說明MSI-H/dMMR單獨作為免疫療效預測仍未滿足臨床需求。
在MSI-H/dMMR CRC中，涉及免疫調節途徑和抗原呈遞途徑的基因常常發生突變，導致免疫逃逸，這或許是部分MSI-H腫瘤對免疫治療無效的原因之一。一項納入22例經免疫治療的MSI-H的mCRC的研究顯示，TMB與ORR和PFS密切相關，所有高TMB患者（TMB＞41Muts/Mb）疾病得到控制、中位PFS尚未達到（中位隨訪時間超過18個月）；而低TMB者（TMB ＜37 Muts/Mb）疾病控制率（disease control rate，DCR）僅33.3%、中位PFS僅2個月，聯合MSI與其他指標預測免疫反應可能更具有前景。
目前NCCN指南建議二線及以上或不能耐受強烈治療的一線MSI-H/dMMR mCRC進行免疫治療。在2020年ASCO GI 公布Checkmate-142研究一線使用納武利尤單抗聯合伊匹木單抗雙免疫治療MSI-H/dMMR CRC的ORR 達到64%，相較於其二線以上的治療結果仍有進一步提高（ORR 55%），可見免疫治療奪取CRC一線治療領地是必然的趨勢。此外，納武利尤單抗聯合低劑量伊匹木單抗治療（ORR 66%）似乎也是優於單藥納武利尤單抗（ORR 31.1%）或帕博麗珠單抗（ORR 33%）。因此，雙免疫治療也是「未來可期」的一種選擇。
檢測不同錯配修復基因的胚系突變對林奇症候群攜帶者有哪些意義？
林奇症候群（LS）是與遺傳相關的一類疾病，以易患包括結直腸癌、子宮內膜癌、胃癌等多種腫瘤和發病時間早為特點。LS是CRC致病機制之一，約佔全部CRC的2-4%。在LS的致病基因中，MLH1佔42%，MSH2約佔33%，MSH6佔18%，PMS2約佔7.5%；此外，位於MSH2上遊的EPCAM基因也可通過導致MSH2甲基化進而導致LS，IHC表現為MSH2、MSH6蛋白缺失，比例約1-3%。通常認為，檢測到MLH1甲基化可基本排除LS，而在受精卵至胚胎早期階段由非遺傳因素導致的MLH1甲基化，仍可歸於LS，並且該類型常常與年輕發病和多原發腫瘤相關，但這種情況極為罕見。
LS中不同MMR基因胚系突變導致的CRC終身患病風險也不同，其中MLH1和MSH2為30-74%，MSH6僅10-22%，PMS2為15-20%。LS患者結腸癌切除術後10年內再次出現CRC的概率為16-19%；接受全結腸癌切除術患者較部分切術患者生存期延長，但年齡越大獲益越小。因此，對年輕、MLH1/MSH2胚系突變患者建議積極行全結腸切除。而MSH6和PMS2胚系突變是否需更激進地行預防性切除目前還存在爭議。此外，CRC患者腸外腫瘤發生風險也明顯升高，以子宮內膜癌最為常見，其他包括卵巢癌、胃癌、前列腺癌等;其中卵巢癌中，由MSH6突變導致的概率高達71%，MLH1和MSH2突變導致的發生率為54%，PMS2為15%，因此建議已生育或40歲以上女性行預防性子宮附件切除術也可能要考慮胚系突變是來源於哪個MMR基因。
LS的篩查意義更多在於對其近親家屬患病的及早發現，甚至預防。目前阿司匹林對CRC的預防作用已經大量研究。阿司匹林對照安慰劑可減小LS患者CRC發生率，但阿司匹林具體劑量和治療持續時間尚有待進一步研究。2019年的AACR年會上公布的一項基於錯配修復系統功能缺失導致染色體編碼區微衛星序列移碼突變的累積而產生移碼突變衍生肽（frameshift-mutation-derived peptides，FSPs）新抗原疫苗的I/IIa期研究結果顯示：接種腫瘤抗原的Lynch症候群小鼠模型，與未接種Lynch症候群疫苗的小鼠相比，顯著降低了腸道腫瘤負荷；與單純接種相比，聯合注射非甾體抗炎藥萘普生，顯著提高了Lynch症候群小鼠的總體生存率。雖然僅是一項臨床前研究，但該研究是開發Lynch症候群患者預防腫瘤疫苗的第一步。
MSI-H/BRAFV600突變結直腸癌的治療如何選擇？
BRAFV600E突變在CRC中發生率約5-10%。由於BRAF突變腫瘤與CpG島甲基化相關，而後者可以引起MLH1啟動子的失活，因而BRAFV600E突變和MSI-H/dMMR關係較為密切，且以散髮型MSI-H/dMMR CRC為主，僅1.4%出現在LS中，通常對BRAFV600E突變的患者不再建議進一步行胚系突變的檢測。研究顯示，MSI-H/dMMR mCRC中BRAFV600E約佔35-50%，BRAFV600E突變的mCRC中約20-55%為MSI-H/dMMR。
BRAFV600E突變CRC腫瘤有較高水平的CD8+腫瘤淋巴細胞浸潤，預示著BRAFV600E突變型患者更可能從免疫治療獲益。KEYNOTE-164研究中，帕博麗珠單抗治療在MSI-H/dMMR CRC的亞組分析顯示：BRAFV600E突變組總緩解率達55%(5/9)；而在Checkmate-142研究中，雙免疫治療MSI-H/dMMR mCRC亞組分析顯示BRAF突變患者的ORR和DCR達55%（16/29）和79%(23/29)；單純從數值上比較，較聯合BRAFV600E、EGFR和MEK抑制劑的兩藥或三藥靶向治療更高（靶向治療ORR 12-26%）。但BRAF突變的靶向治療研究中未對MSI狀態進一步進行亞組分析。
在黑色素瘤中，目前建議腫瘤負荷較大的BRAFV600E突變患者先進行BRAFV600E/MEK抑制劑達到快速縮小腫瘤目的，後進行免疫治療，且基於BRAFV600E抑制劑有增強免疫反應的臨床前試驗結果，目前靶向聯合免疫治療的研究也在火熱進行，並且取得了不錯的結果。而靶向治療在BRAFV600E突變的CRC療效似乎沒有那麼出彩，因此對於MSI-H/dMMR伴BRAFV600E突變的CRC患者，我們更傾向於優先選擇免疫治療，進展後考慮多靶點靶向治療。未來針對這個非常特殊的人群，免疫治療和靶向治療的使用先後順序甚至聯合使用都需進一步臨床研究探索。
綜上，MSI-H/dMMR是目前CRC全程管理中的重要指標分子標記物，無論是對患者的遺傳篩查、預後和治療決策的選擇均發揮了重要作用，因此建議對所有CRC患者進行微衛星檢測。同時，MSI-H/dMMR CRC還存在許多未知和爭議，仍需在臨床運用中和基礎研究中不斷探索。