古多倍化在被子植物進化適應的遺傳貢獻

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摘要

祖先全基因組複製（WGDs 或polyploidy）在植物中是正常的，一些全基因組複製事件的發生伴隨著嚴重的地球環境的改變。因此，全基因組複製事件可能促進了植物的適應性。然而仍然缺乏經驗證據來支持這些假設。這篇文章，我們通過調查在被子植物系統發育層面從祖先全基因組複製事件中保留下來的複製基因，以及針對探索遺傳證據來支持重要的多倍化事件。在我們所選取的25個物種中，那些複製的基因從三次獨立的全基因組複製事件（分別在~120Ma,66Ma和<20ma）中協同保留。基因家族的功能在低溫和黑暗下通常保持基因複製在8次獨立出現在白堊紀-古新世紀基因組複製事件之後，在白堊紀-古新世期間具有全球變冷和黑暗環境的雙重壓力。除此之外，共同保留的複製可以作為促進了與壓力有關通路產生的堅實證據。另外，全基因組複製之後，在基因廣度上轉錄因子（transcription< span=""> factors）功能在壓力下趨於保留重複，並且協同選擇的基因在許多世代中都保留了基因重複基於這種環境壓力。因此本文結果表明，被子植物的古多倍化事件在其適應全球環境的改變的進化歷史中起了促進作用。

關鍵詞：全基因組複製、古多倍化、適應性進化、phylogenomic、白堊紀-古新世、基因調控網絡

介紹：

被子植物（或也稱有花植物）是植物王國中多樣性最多的植物，大約已知有350000種。達爾文描繪了晚白堊紀中期「一個惱人之謎」-被子植物快速發展和早期多樣性的形成。當前，被子植物作為地球上的優勢物種，從熱帶到極地地區以及水生地區都有覆蓋。這種成功得益於被子植物進化歷史中的全基因組複製事件。全基因組複製事件被認為是進化上的重要驅動力，不管是物種形成、適應性進化或是多樣性產生。

最近的兩次刪除和巨大影響已經說明全基因組複製事件相比之前的進化歷史更廣布於有花植物中。之前的兩次古老的全基因組複製事件被認為在被子植物和種子植物中是有代表性的。被子植物兩個主要的進化枝，即雙子葉和單子葉植物進化枝，在早期的進化歷史中都經歷了古多倍化事件，它們分別被稱作gamma（γ）和tau（τ），另外全基因組複製事件出現在許多具有共同祖先的類群中，比如菊科、十字花科、葫蘆科、豆科和禾本科Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, and Poaceae。除此之外，全基因組複製事件出現在很多譜系lineage（隨不同時期的一系列祖先和後代種群，通常指單一的正在進化的物種，但也可能包括來自共同祖先的多個物種）中。例如，擬南芥的三次全基因組複製事件（γ-β-α）出現於從單子葉植物中分化出來之後；香蕉中的musa一支的三輪全基因組複製事件出現在從禾本科分離之後。

另外，之前的研究已經發現全基因組複製事件不是在被子植物系統發育位置中漫無目的分散式的，而且暗示全基因組複製事件是受環境選擇的。全基因組複製事件出現在白堊紀-古新世（K-Pg）且獨立存在於許多植物譜系中，表明全基因組複製事件有能幫助物種度過極端環境的作用。多倍化可以協同C4 grassland的擴張和對最近的冰川期的最大適應。因此全基因組複製推測對於協同度過極端環境和滅絕事件。然而，全基因組複製事件在適應性進化過程中，促進和具有很強的重要性在遺產層面的證據仍存在較大空白。

眾所周知，多倍體通過添加一組額外的基因組同時複製成百上千的基因，這些基因為進化提供了大量的遺傳材料，在隨後的分化和二倍化過程中，大量的基因很快恢復到單拷貝階段，而保留那些被認為有特殊重要性的遺傳特性比如新功能化的和子功能化的基因。除此之外，複製的基因可能會導致基因調控網絡的改變，這些改變有利於提高植物的適應性。

為了探索全基因組複製事件的重要性，本文全面的跟蹤了25個植物物種全部基因家族的進化歷史，並且發現遺傳修飾發生於全基因組複製事件之後。首先，選取被子植物中具有代表性的25個測序的植物基因組，這些基因組被用於全部重建基因家族，並且通過系統發育分析去注釋那些在全基因組複製事件之後被保留的重複基因。接下來，我們看注釋的這些在全基因組複製事件後保留重複的基因家族從某些極端環境改變到遺傳水平下的潛在選擇信號。最後，通過轉錄組數據和整合之前已報導的通路，重建基因調控網絡，從我們提供的證據上顯示，在環境選擇壓力下，保留的重複序列能夠促進基因調控網絡響應。

結果

注釋全基因組複製事件後被保留的旁系同源基因

為了辨認植物全基因組複製事件中促進了哪些遺傳特性的產生，本文調查了21個被廣知的在被子植物進化歷史中的多倍化事件。本文選取了25個基因組測序的植物並且從蛋白質翻譯水平上選取了基因家族。對66509個直系同源組利用OrthoMCL工具尋找直系同源基因。在這些直系同源組orthogroups中，12077個直系同源組具有4個或多個基因，包括來自外類群(小立碗蘚、卷柏、無油樟)中至少一個基因被用於構建系統發育樹。接下來，系統發育分析被查找那些複製事件來自於哪些基因家族的系統發育。

圖1 在陸生植物的進化歷史中，推斷在每一次的全基因組複製事件後大量的基因家族保存下來，然後複製

系統發育樹展示了本文研究的25個物種的拓撲結構和分化時間。25個物種的進化關係基因是基於當前被接受的拓撲結構（APG系統），分化時間在TimeTree 網站上算出。已知的全基因組複製事件用圓形標出，三倍化事件用方形標出。在120Ma,66Ma,<20ma< span="">是全基因組複製事件發生頻率較高的地方，分別用綠色、橙色、和藍色代表。在每個全基因組複製事件中基因家族的複製分別在圓形和方形圖標裡標出。共線性證據（synteny evidence）用虛線圈出。左上方的示意圖表示了在白堊紀-古新世的環境壓力。

為了確定大量的複製來自於全基因組複製事件，染色體上的複製基因裡的串聯重複（tandem duplications）必須首先被移除，串聯重複可能來自於祖先小尺度上的複製。（方法）。此外，每個物種的共線性分析能夠為本研究中發現的大部分重複提供支持。另外，由於兩個連續的全基因組複製事件之間缺少分支物種，例如在小果野蕉中，一些重複項不好分類。於是便計算了每個同義位點的同義替換，來了解來自某些複製事件的倖存基因。綜上，我們匯集了來自全基因組複製事件中所保留複製的基因家族。

在全基因組複製事件後三個時期的基因保留模式

一次全基因組複製事件可以生成大量的複製基因，這些基因可以為進化提供大量的遺傳材料。如果獨立的全基因組複製事件可以幫助物種在環境變化中得以生存，同樣功能的基因也可以在不同物種中被保留，在共同的環境選擇壓力下。

在系統發育樹中25個物種裡選取了21個陸生植物，其中14種經歷了多倍化高峰（3次多倍化高峰，120Ma,66Ma,<20ma< span="">），在大約120Ma被稱為γ和τ事件使早期的雙子葉植物和單子葉植物分化。第二次是我們所熟知的K-Pg boundary附近出現的大量的全基因組重複事件。最近的全基因組複製事件發生在小於20百萬年，出現在大豆玉米等進化歷史中。

圖2 基因家族在三次高峰期的壓力響應模式

（A）韋恩圖顯示共享和特定基因家族在某個時期裡多次全基因組複製事件發生後仍然存在的基因家族。數字代表了具有基因複製的基因家族數量。方括號裡代表了全基因家族複製事件中具有複製的基因家族的數量。（B）在三次全基因組複製浪潮中，壓力選擇下的基因功能。

我們發現在許多物種中，包含基因家族確實存在來自幾個獨立的全基因組複製事件的基因複製（圖2A），並且這些基因看似都受到了環境選擇的壓力信號。66個基因家族共同包含了基因複製在所提到的三個高峰期期間（補充圖2），包含了蛋白激酶、轉運蛋白和蛋白結合基因家族（補充表3）。320個基因家族保留了最古老的全基因組複製事件（γ和τ）而來的重複序列，它們豐富了響應缺水和鹽脅迫的相關基因。（圖2B），這可能跟120Ma的乾旱氣候有關係。第二輪的全基因組複製事件的高峰期位於K-Pg boundary附近，當時幾個極端氣候條件出現，包括全球變冷、黑暗、酸雨和大火。493個基因在至少6次全基因組複製事件中重疊（圖2A），豐富了壓力-聯繫下的基因，包括了冷熱脅迫、滲透壓維持、鹽脅迫、水分獲取和創傷修復（圖2B），以及與壓力響應相關的其他生物過程（例如脫落酸abscisic信號通路、細胞對磷酸鹽的飢餓響應、防禦反應、和karrikin響應補充圖3）.我們同時也去看了K-Pg boundary附近的沒有發生古多倍化的5個譜系，發現有12個基因家族有小尺度的基因家族複製事件（補充圖4）而且這些基因家族僅編碼了在植物代謝過程中用到的酶和轉運蛋白，這些編碼區域不能直接反應對環境的適應性（補充表4）。最近的全基因組複製事件的高峰期發生在20Ma以內，並且仍然複製了844個基因家族（圖2A），這個過程中保留下來的基因家族成員，與抗高鹽、寒冷、水分獲取、以及創傷修復。這些可能與當時記載的地球低二氧化碳濃度以及氣溫下降相關。通過GO注釋或許不僅可以部分解決環境的改變，也能暗示不同譜系下的其他環境選擇。

轉錄因子基因家族在全基因組複製事件後具有偏向性保留

TF（行）根據其保留值進行聚類，而WGD（列）根據其發生時間進行分組。熱圖頂部的基因家族是繼WGD之後的高保留家族，而熱圖底部的基因家族是低保留的家族。左上方的彩色鍵表示TF的保留值。熱圖的每個單元格中的數字表示相應的WGD之後每個TF的保留值。熱力圖單元格後面的轉錄因子基因家族名稱後邊括號裡的數字指的是在orthogroup中屬於轉錄因子基因家族的基因數量。

轉錄因子扮演著控制在基因規律性的轉錄的作用，比如生長、發育和脅迫回應。之前的研究也表明在全基因組複製事件之後，轉錄因子是廣泛過度保留的基因。

本文在解釋全基因組複製事件後轉座因子複製基因的保留模式時利用保留值（retention value 即R value）來評估。通常主要的轉錄因子在全基因組複製事件後趨於被保留，數據結果也在前人的文獻中有報導。但是，本文發現不是所有的轉錄因子基因家族都被過度保留，而是在不同的轉錄因子基因家族中保留特定的保留偏好（圖3）。例如高保留的基因家族包括（ARF, C2H2, C3H, CO-like, ERF, G2-like, GRAS, HD-ZIP, HSF, LBD, MYB, NAC, Trihelix, WRKY, bHLH, and bZIP）基因家族，而且趨於在多次全基因組複製事件後多次保留複製，且在不同的譜系當中（圖3）。基於前人報導，許多高保留的轉錄因子基因家族基因在不同的發育階段響應生物和非生物脅迫。大部分低保留的轉錄因子基因家族功能與保守的生物過程有關。例如，LFγ控制的生長發育開關和LAD1控制細胞程序性死亡的通路。

那些在特定的全基因組複製事件浪潮中複製的轉錄因子基因，被認為是促進物種在環境改變下而具有的特殊遺傳特性。協同保留的轉錄因子基因在120Ma時主要參與了植物的生長、發育、形態發生和脅迫響應（補充表5）。例如，被保留的基因複製基因和他們的功能分化在4個直系同源的MADS-box基因家族在核心真雙子葉植物和單子葉植物。兩個熱脅迫相關的轉錄因子的直系同源基因在響應熱脅迫是扮演著重要作用。然而，在K-Pg boundary附近的共保留的轉錄因子主要參與多種非生物脅迫（補充表6）。C2H2、ERF、RAV家族的直系同源基因參與了低溫響應，HD-ZIP基因家族的直系同源基因參與了庇蔭症候群（shade-avoidance syndrome）和dehydration stress response脫水應激反應。直系同源基因WRKY基因家族對於響應低磷酸鹽脅迫相關（補充表6）。

全基因組複製事件促進了更複雜基因調控網絡的形成

由於全基因組複製事件可能可以給基因調控網絡重新布線（rewire），因此本文去探索了WGD在適應K-Pg boundary附近環境變化重塑了哪些基因調控網絡。

在整體的滅絕期間，全球範圍內的低溫是主要的環境壓力。其中C-repeat/DREB結合因子通路(即CBF通路)是目前文獻報導的已知的主要調節冷信號的通路。目前這種信號通路在擬南芥中被研究。CBF基因，作為響應這個通路的關鍵基因，主要被上遊的ICE和CAMTA轉錄因子調節，並且能夠在冷脅迫下觸發許多寒冷響應基因（COR響應基因）的表達。

通過追蹤CBF途徑中關鍵基因家族的進化歷史，我們發現CBF，ICE，CAMTA和其他相關家族（SIZ，EIN等）在許多不同譜系中均呈重複狀態（圖4A）。在擬南芥中ICE1-ICE2基因在β全基因組複製事件中被複製（圖4B、C）。ice1丟失功能的突變體對耐寒脅迫變得敏感，這就導致相比野生型在存活率上減少。過表達的ICE2從植物的基因改造上極大的增強了植物的冷適應。在水稻中，CBF基因作為一個多拷貝被保留在ρ全基因組複製事件之後，這個基因也在冷脅迫上扮演著重要角色（補充圖5）.因此，在不同的譜系中，仍然被保留在K-Pg boundary發生的全基因組複製事件中的複製基因，極大的增多了拷貝數量，並且出現了複雜的CBF-獨立信號網絡功能在核心真雙子葉植物和單子葉植物的寒冷耐受性上（圖4B）。

圖4 冷響應關鍵基因的調節模式在K-Pg時期的全基因組複製事件之後

（A）在K-Pg邊界處的8個WGD後，被子植物CBF依賴性信號通路中,已知的重要基因家族的重複保留狀態情況。ICE，CAMTA和CBF是關鍵的轉錄因子基因家族，而SIZ，OST，EIN和FRY是其他與CBF依賴性信號通路有關的相關基因家族。「 x」表示沒有保留，實心點表示基因保留。（B）擬南芥中WGD後CBF依賴性信號傳導途徑的擴增和重塑插圖。ICE1和ICE2從βWGD複製。CBF1，CBF2和CBF3是通過串聯重複生成的。（C）ICE基因家族的系統發育顯示其進化史上的重複。實心圓圈表示重複發生在不同時期。具有ICE基因的共線性模塊位於系統發生樹的右側

本文還對某些譜系的多倍化事件後的CBF通路成員網絡進行了比較。共表達基因已經廣泛被用於鑑定基因功能。為了研究擬南芥譜系中的網絡進化，葡萄是理想材料，因為在發生γ事件後經歷了額外的全基因組複製事件。我們分別使用162個擬南芥和60個葡萄RNA-seq數據構建了冷特異性共表達網絡（見方法）。對於從β WGD中複製而來的ICE基因，我們解釋擬南芥中的AthICE1 and AthICE2共表達網絡，以及在葡萄中的直系同源基因VviICE。（圖5）.大多數在VviICE上共表達的基因，在AthICE1 and AthICE2的直系同源基因上也被聚到一起。並且在擬南芥中共同響應的基因可能被分為三類：僅與AthICE1共表達、僅與AthICE2共表達、既與AthICE1共表達也與AthICE2共表達（圖5），暗示在WGD後，複製的ICE基因子功能化。另外，相比葡萄VviICE，擬南芥在α、βWGD後，複製的AthICE1 and AthICE2招募了更多額外的基因，有助於增強對寒冷的耐受性。

圖5 擬南芥中複製的ICE1和ICE2基因與馬鈴薯中直系同源基因ICE共表達網絡比較。ICE1和ICE2基因通過β WGD產生，紅色波浪線表示直系同源匹配，也就是它們能夠聚集在一個直系同源組中。綠色的虛線表示二者正調控共表達關係。紅色四個在擬南芥中之前報導過的與耐寒相關的基因

黑暗（或暗光）是物種在大滅絕過程中遇到的另一個主要環境壓力，這是由於大氣塵埃長時間反射了陽光。我們調查了植物避光途徑中的關鍵成分，並且還發現在WGDs中，多個譜系裡複製了幾個關鍵基因。圖6A。在擬南芥中，HD-ZIP II基因家族中的ATHB2和HAT1都來自βWGD（圖6B和6C），它們在避開蔭涼區響應中起作用。分子遺傳學分析顯示ATHB2可以迅速感應低紅光：與野生型相比，遠紅光在擬南芥上和athb2功能喪失的突變體都顯示出下胚軸伸長並且避陰能力大大降低。以擬南芥為例，圖6B為從之前的WGD到後來的WGD調控網絡的推定模型。儘管預測的祖先網絡有些不確定，但我們的證據還是相對明顯的，我們證明了全基因組複製事件後，避開遮陰的地方這一功能得以擴展。這樣可以增強對光信號的感知，並更好地適應弱光環境。

Figure 6. The Retention Pattern of Key Genes in Shade Avoidance Pathway after WGDs around the K-Pg Boundary

為了測試植物適應性與全基因組複製事件之間的聯繫，我們比較了三波全基因組複製事件中冷脅迫和黑暗脅迫的特定保留模式，在後兩次的WGD浪潮中，由於全球氣溫降低，所以冷脅迫基因被保留時具有高選擇性。全球的黑暗環境僅在K-Pg期間被報導。Shade avoidance 通路在K-Pg附近的保留比另外兩個WGD 保留高出很多（補充圖6）.另外，我們研究了另一種耐受途徑（Na+ tolerance），儘管這個鈉離子耐受途徑沒有成為K-Pg附近的主要途徑。鹽過度敏感（SOS）信號傳導途徑具有一定的功能性，在高鈉離子耐受性下可以維持離子的穩態。補充圖7A。SOS途徑的核心成員（例如SOS3，ScaBP8，SOS2和SOS1）的重複有偏差地保留。補充圖6和7B.因此，與脅迫相關的基因調控網絡中 的基因在全基因複製事件中被有偏向性的保留，說明這是一個很有利的證據，即全基因組複製事件提高了植物在應對全球環境改變時的適應性。

討論

自然界中的被子植物定期發生的古多倍化事件

為了建立古多倍化遺傳促進與適應性進化之間的聯繫，需要標記被子植物大多全基因組複製事件。多倍化在自然界中很常見。然而新生的多倍化個體往往會遇到各種內在的或者外在的障礙，包括染色體分離錯誤發生率的增加，有效種群的減少，以及與祖先二倍體競爭等。多項研究表明多倍體通常是進化的死角。最近行程的多倍體必須找到與之相應的二倍體不同的某些生態位才能生存。多倍體植物可以遷移到一個新的沒有其二倍體祖先競爭的但充滿選擇壓力的環境，或者經過強大的環境選擇後將二倍體祖先替換成多倍體，從而生存下來。因此，被子植物的古多倍化事件與全球環境變化同時發生，可能在多倍體建立過程中發揮了重要作用。

推斷全基因組進化的意義與挑戰

由於反覆發生和大量的基因損失，剩餘的古多倍化信息變得複雜和模糊。另外環境選擇壓力通常不會持續千年之久。環境條件改變後，全基因組複製帶來的遺傳貢獻可能就消失了。此外，雜交和重組還可以去除關鍵的遺傳信息，這些信息可以幫助物種在特定時期內經受嚴峻的環境變化。因此在被子植物的多倍化研究中存在很大的挑戰。最後，我們調查了在同一時期發生的幾個獨立的WGD，以尋找共享的重複基因。