Immunity:腸道微生物調控外周淋巴結發育

2020-11-30 生物谷

（淋巴細胞（T和B）在樹突狀細胞（DC）的調控下，抵禦腸道微生物的入侵，圖片摘自「清華免疫」微信公眾號）

2016年2月17日 訊 /生物谷BIOON/ --在出生前的淋巴結發育過程中，淋巴囊（primitive lymph sacs）首先通過淋巴管分化活動（lymphatic vascularization）形成淋巴結原胚（lymph node anlage）。這一過程需要受到一群叫做"淋巴結引導細胞（lymphoid tissue inducer cell，LTi）"的調控，這類細胞實際上是一類CD4+CCR6+NKp46 的III型天然免疫細胞亞群。LTi細胞接收到來自視覺神經末梢分泌的視黃酸（retinoic acid，RA）的刺激，進而引發淋巴結的初始發育。

出生之後，LTi細胞不再存在於淋巴結中，但淋巴結仍舊繼續發育。出生兩周之後，小鼠淋巴結開始出現T區與B區的分隔；然而，外周淋巴結的發育在無菌小鼠中受到了抑制。這一現象表明腸道微生物對於出生後次級淋巴器官的發育具有重要的作用，不過其中的分子機制並不清楚。

血液中的淋巴細胞通過高內皮靜脈（high endothelialvenules，HEVs）進入淋巴結中。這一過程首先是由一些地址素（addressin）的引導，其中包括a4b7的受體MadCAM-1以及CD62L的受體PNAd。在剛出生的小鼠中，MAdCAM-1的表達量較高，隨著時間的推移，大約兩周以後，PNAd的表達量佔據主導地位。這一上調引導了基於L-選擇素（L-selectin）的成體淋巴細胞歸巢的效應。有報導指出，一類表達趨化因子受體CCR7的樹突狀細胞（DC）能夠進入次級淋巴器官，進而促進高內皮靜脈（HEV）的發育，但這類DC的活動是否受到腸道微生物的調節仍未可知。

在SPF小鼠中，腸道相關淋巴結的發育受到一系列轉錄因子的調控，包括ID2, IRF8, Batf3, IRF4。同時也受到 Notch2-依賴型RALDH+&CD11b+CD103+DC的調控。這類DC十分特殊，有報導指出這類DC能夠將常規CD4+T細胞轉變為誘導型Treg細胞，以及誘導淋巴細胞的歸巢行為。因此，這類細胞很可能受到腸道微生物的調節，進而影響淋巴結的發育。

對此，來自清華大學醫學院免疫學研究所的石彥教授課題組利用無菌培養小鼠模型與基因表達譜分析手段，證明了腸道微生物對RALDH+DC以及淋巴結發育的影響。相關結果發表在最近一期的《Immunity》雜誌上。

首先，為了證明無菌小鼠中外周淋巴結的發育缺陷現象是由淋巴細胞歸巢能力下降導致的，作者們利用CFSE標記了一定量的淋巴結細胞並通過尾靜脈注射的方式分別導入SPF小鼠與GF（即無菌）小鼠體內。實驗結束24小時之後，在SPF小鼠以及GF的腹股溝淋巴結，腸繫膜淋巴結以及脾臟中都檢測到了CFSE陽性的細胞群體。但是，相比於脾臟，GF小鼠的腹股溝淋巴結以及腸繫膜淋巴結中的CFSE陽性細胞數量明顯低於SPF小鼠。進一步的細胞特徵分析也表明，CD4+T細胞，CD8+ T細胞，以及CD19+B細胞數量都明顯減少。同時，作者發現五周左右的GF小鼠腹股溝淋巴結HEV中MAdCAM-1的表達量仍未下調，而PNAd的表達量也未明顯上調，GF小鼠的淋巴結大小也明顯低於SPF小鼠。通過將SPF小鼠與GF小鼠進行一段時間的共室培養後，作者發現GF小鼠HEV中兩類地址素的表達量特徵開始與SPF小鼠靠攏。這說明腸道微生物可能影響了HEV的生理特徵。之後，作者將GF小鼠與SPF小鼠不同淋巴結的RNA提取出來並進行了深度測序。有意思的是，MAdCAM-1與PNAd-1的RNA表達水平並沒有明顯差異。這說明這一蛋白水平的差異可能是由於轉錄後調控的變化導致的。有意思的是，SPF小鼠中與脂肪代謝以及視黃酸信號通路的相關基因表達量明顯高於GF小鼠。

維他命A（VitA）富集於脂肪細胞中，它能夠激組織分化過程中的視黃酸（RA）信號。視黃酸脫氫酶（RALDH）能夠將維生素的衍生物-視黃醛，轉變為視黃酸。為了檢測SPF小鼠中RALDH的表達量，作者利用CD1特異性視黃酸-beta-乳酸脫氫酶報告基因小鼠，提取了體內的腹股溝淋巴結細胞並進行了體外培養與孵育與檢測。結果顯示，在SPF小鼠的腸繫膜淋巴結（MLN）中，有1%為RALDH+細胞，然而在GF小鼠中難以檢測到。相似結果也出現在PP，LP中。之後，作者將GF小鼠與SPF小鼠進行了共同孵育。結果顯示：共同孵育之後GF小鼠的淋巴結中RALDH+細胞的數量明顯上調。

由於之前一致認為RALDH+細胞主要存在於大腸中，那麼外周淋巴結中pLN的存在表明其可能具有此前未知的生理功能。為了證實這一猜想，作者提取了SPF小鼠體內的RALDH+ 細胞並將其通過靜脈注射的方式導入五周左右的GF小鼠體內。7天以後，再次將CFSE標記的SPF LN細胞通過靜脈注射的方式導入小鼠體內並觀察其歸巢能力。結果顯示：在RALDH+細胞導入的小鼠中，CFSE+細胞向mLN，iLN中歸巢的能力明顯高於對照組。這說明RALDH+細胞的確能夠影響淋巴細胞的歸巢行為。

之後，作者希望了解腸道微生物是如何影響RALDH+細胞的生理功能的。首先，作者對這部分RALDH+細胞進行了鑑定，證明它們的確屬於腸道分布的CD103+ CD11b+DC，進而表明腸道微生物的存在能夠引起這部分細胞從腸道向外周淋巴結遷移。之後，作者利用不同類型的抗生素進行處理，發現RALDH+DC的遷移受到一類叫做"熱帶假絲酵母"的腸道真菌的調控。

進一步，作者發現RALDH+向外周淋巴結的遷移能夠引起HEV地址素的表達譜的變化，即降低MAdCAM-1的表達量，同時升高PNAd的表達量。另外，作者發現這部分從腸道遷移過來的DC能夠在外周淋巴結中對淋巴細胞進行"教育"，從而引導它們成熟後向腸道組織遷移。

最後，作者給SPF小鼠飼餵缺乏維生素A的飼料，證明了維生素A是完成這一活動的必須元素。

綜上，作者闡釋了腸道存在的一類特殊的DC（CD103+ CD11b+ RALDH+），該類細胞在小鼠出生初期能夠響應腸道內熱帶假絲酵母的刺激，向外周淋巴結中遷移，這一過程進而促進外周淋巴結的發育以及淋巴細胞的歸巢活動。至於腸道微生物是如何調節DC的行為，以及外周淋巴結是如何進行發育的問題，需要進一步研究。（生物谷Bioon.com）

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DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2016.01.004

PMC:

PMID:

Peripheral Lymphoid Volume Expansion and Maintenance Are Controlled by Gut Microbiota via RALDH+ Dendritic Cells

Zongde Zhang, Jianjian Li, Wencheng Zheng, Guang Zhao, Hong Zhang, Xiaofei Wang, Yaqian Guo, Chuan Qin, Yan Shi

Lymphocyte homing to draining lymph nodes is critical for the initiation of immune responses. Secondary lymphoid organs of germ-free mice are underdeveloped. How gut commensal microbes remotely regulate cellularity and volume of secondary lymphoid organs remains unknown. We report here that, driven by commensal fungi, a wave of CD45+CD103+RALDH+ cells migrates to the peripheral lymph nodes after birth. The arrival of these cells introduces high amounts of retinoic acid, mediates the neonatal to adult addressin switch on endothelial cells, and directs the homing of lymphocytes to both gut-associated lymphoid tissues and peripheral lymph nodes. In adult mice, a small number of these RALDH+ cells might serve to maintain the volume of secondary lymphoid organs. Homing deficiency of these cells was associated with lymph node attrition in vitamin-A-deficient mice, suggesting a perpetual dependence on retinoic acid signaling for structural and functional maintenance of peripheral immune organs.

 

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