張明傑組報導相分離介導突觸小泡定位到突觸前膜活性區的機制

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突觸（Synapse）作為神經元（Neuron）之間傳遞信號的化學結構，由突觸前膜、突觸間隙、突觸後膜組成。神經遞質（Neurotransmitter）包裹在突觸小泡（Synaptic Vesicle，SV）中，經過栓系（Tethering）、對接（Docking），被定位到突觸前膜活性區（Active Zone），再經過活化（Priming）過程，才可以響應動作電位（Action Potential），致使SV與突觸前膜融合（Fusion）並實現神經遞質的釋放。活性區作為SV釋放神經遞質的位點，其重要性毋庸置疑，但是SV究竟如何定位到活性區卻懸而未決。長期以來，多對分子層面的蛋白質-蛋白質相互作用被發現參與到SV的釋放過程，而對磷脂膜和蛋白質之間的相互作用、亞細胞尺度的相互作用卻鮮有研究。

已知SV在突觸前膜大致分成3個亞群，其中最大的一群由synapsin維持在突觸前膜遠端，叫做儲備池（Reserve Pool），它們只有被定位到活性區成為即刻可釋放池（Readily Releasable Pool, RRP）才有機會被釋放，另有一小亞群在兩者之間穿梭，又稱循環池（Recycling Pool）【1】。有意思的是，這3個亞群的SV並沒有明確的形態學或分子組成的區別，其功能的差異性似乎是由其所處的位置決定的，而不同亞群的SV由不同蛋白質維持【2-5】。早前有報導指出，synapsin的相分離可以對儲備池的SV起到維持作用【6】，那麼RRP又怎樣維持呢？

2019年1月17日，香港科技大學張明傑教授課題組在Molecular Cell上發表了題為RIM and RIM-BP form presynaptic active zone-like condensates via phase separation的研究論文【7】，揭示了由相分離介導的突觸前膜活性區的組織方式，一改以往大家對活性區的認識。基於這種新的蛋白質相互作用網絡的組織方式，SV與活性區的直接相互作用重新進入研究視野（詳見BioArt報導：Mol Cell | 張明傑組報導相分離對於重新認識突觸的形成與維持的重要意義）。

2020年11月16日，張明傑教授課題組再次在Molecular Cell發表題為Vesicle tethering on the surface of phase separated active zone condensates的研究論文，直指SV在突觸前膜活性區的定位機制。研究者發現，人工合成的小單層脂質體（Small Unilamellar Vesicle， SUV）和從大鼠腦中直接純化的SV，都可以直接吸附到RIM和RIM-BP形成的蛋白質凝聚體上（圖1A），而不是像synapsin那樣，和SV形成共定位的凝聚體（圖1B），提示活性區蛋白質凝聚體和synapsin的蛋白質凝聚體對SV有著不同的相互作用方式，很可能以此區分SV的身份。

圖1 突觸小泡覆蓋在RIM/RIM-BP凝聚體表面（A）或者與synapsin形成共凝聚體（B）

研究者繼而製備了巨型單層脂質體（Giant Unilamellar Vesicle, GUV）來模擬突觸前膜，在體外實現了「SUV-RIM/RIM-BP凝聚體-GUV」的重構（圖2），模擬了「突觸小泡-活性區-突觸前膜」的結構。

圖2 「突觸小泡-活性區-突觸前膜」的體外重構

研究者進一步推測，synapsin和RIM/RIM-BP很有可能都通過相分離和SV產生聯繫，但是不同的作用方式導致了SV不同的定位效果。於是決定將synapsin，RIM/RIM-BP和SV混合在一起。令人驚訝的是，synapsin和RIM/RIM-BP的凝聚體並不融合，而是形成了synapsin凝聚體包裹著RIM/RIM-BP凝聚體的共凝聚狀態，SV則選擇和synapsin共定位，並覆蓋環繞在RIM/RIM-BP凝聚體表面（圖3）。

圖3 synapsin-SV共凝聚體與SV覆蓋的RIM/RIM-BP凝聚體互不相融

接下來研究者們決定再次引入GUV來模擬突觸前膜，並成功實現了「synapsin/SUV共凝聚體-SUV覆蓋的RIM/RIM-BP凝聚體-GUV」結構的體外重構（圖4），模擬了整個突觸結（synaptic bouton）的多層組織的結構特徵：（1）由synapsin凝聚體維持的儲備池；（2）由活性區凝聚體維持的RRP；（3）互不相融的synapsin和RIM/RIM-BP凝聚體以及以此區分的儲備池與RRP；（4）直接貼附在突觸前膜上的活性區。

圖4 由相分離介導的突觸結的體外重構

正如其中一位評審評價的那樣：「The paper uses sophisticated experimental methods to put forward a model of presynaptic organization through phase separation. This is an attractive approach that provides further evidence that this important biochemical process (phase separation) may organize the nerve terminal and an entire synapse.」 綜合張明傑教授實驗室近年對突觸後膜緻密區、突觸前膜活性區的其他研究【7-12】，這篇文章無疑為相分離介導整個突觸的形成提供了又一力證。此外，該研究還發現了一種新的亞細胞結構之間的相互作用方式，這種由相分離介導的無膜細胞器、與典型的有膜細胞器之間的相互作用不僅存在於神經系統中，而且也應該存在於其他生命體系，所以該研究對整個細胞生物學的研究有著普適的意義（圖5）。

圖5 普遍存在的有膜和無膜細胞器之間的相互作用

香港科技大學張明傑教授為本文通訊作者，博士生吳先登為第一作者。該研究與德國馬-普研究所著名神經科學家Reinhard Jahn教授合作完成，Marcelo Ganzella博士、周錦川博士、博士生朱仕瀚對該研究亦有貢獻。

原文連結

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.10.029

製版人：琪醬

參考文獻

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12.Wu, X., Cai, Q., Feng, Z. & Zhang, M. Liquid-Liquid Phase Separation in Neuronal Development and Synaptic Signaling. Dev Cell, doi:10.1016/j.devcel.2020.06.012 (2020).