神經疾病藥物開發中的主要挑戰之一仍然是血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）。儘管動物模型對藥物發現有重要貢獻，但動物模型仍難以在分子和細胞水平上對屏障功能以及與藥物的相互作用進行機理研究。
喬治亞理工的課題組開發了微生理平臺，概括了人類BBB的關鍵結構和功能，並使3D映射的納米粒子分布在血管和血管周圍。通過細胞相互作用、關鍵基因表達、低滲透性和3D星形細胞網絡來證明BBB結構並在片上進行擬態。結果表明其反應性神經膠質減少。同時極化aquaporin-4（AQP4）分布減少。此外，該模型可精確捕獲3D納米顆粒在細胞水平上的分布，並通過受體介導的胞吞作用展示了獨特的細胞吸收和BBB滲透。
這一BBB平臺可以作為一種動物模型的補充體外模型，以預先篩選候選藥物來治療神經系統疾病。
前言
血腦屏障（下稱BBB）是中樞神經系統（central neural system，CNS）的高度功能化的血管邊界，可調節物質在血液與大腦之間的輸運。屏障功能主要歸因於星形膠質細胞的三維網絡特有的獨特血管周圍結構，該網絡與內皮細胞和周細胞相通。星形膠質細胞形成BBB的神經膠質細胞，其末端接觸血管並控制水通過Aquaporin-4（AQP4）流入。包埋在基底膜中的周細胞圍繞內皮包裹，並促成星形細胞極化。
BBB處的這些複雜的細胞相互作用維持了其完整性並限制了藥物的滲透，導致中樞神經系統疾病治療劑開發的成功率較低。由於物種差異，動物模型通常無法預測人類的藥物反應。
這些挑戰突出了開發體外模型的重要性，該模型模仿人類BBB的基本生理結構和功能，並以可控方式重現健康和屏障功能的關鍵關係。
亮點
具有3D星形網絡的微納血腦屏障模型
這一模型通過與人星形膠質細胞（human astrocytes，HAs）的3D網絡直接接觸的腦血管內皮和人腦血管周細胞（human brain vascular pericytes，HBVP）重建BBB結構。
BBB晶片具有兩個分隔的微流體通道層，這些通道層將2D內皮單層與3D腦微環境結合在一起，從而能夠獨立地對每個空間中的分子分布進行高度靈敏的定量。該裝置的上層模擬大腦微脈管系統的血管空間，在該膜上，在7μm厚的多孔膜（直徑8μm的孔，密度為1E5孔/cm2）上形成內皮單層，其中導入16μL/min連續流體流動（剪切應力：4 dyne/cm2）。下層中央通道為3D基質膠（5 mg/mL）和兩側通道中容納膜和星形膠質細胞下面的周細胞。這種結構允許在水凝膠中進行3D星形膠質細胞培養，該凝膠插入中央通道並通過表面張力穩定保持。重要的是，上通道的邊緣應對齊以覆蓋微柱的兩側陣列，以避免由於內皮異質形成而在矩形橫截面的微流體裝置的邊緣導致洩漏。
該設備的設計目的是將培養基成分擴散輸送到水凝膠通道中，並在上部和兩側通道中進行介質更新。而且，兩個側通道促進了通過水凝膠的獨立的側向灌注，從而能夠有效地去除代謝廢物或未結合的抗體。更重要的是，提供了從水凝膠中精確採樣溶液的機會，而不會干擾細胞組織。
在培養2.5天後，具有完整功能的人血腦屏障可以生成。完成的BBB模型可重現性維持HAs的3D網絡，該3D網絡具有在內皮單層下並穿過下通道層的生理相關形態。HBMEC和HBVP的單層位於7μm厚的多孔膜的相對兩側，而鄰近結構和可灌洗的結構允許這三個細胞之間的旁分泌和鄰分泌分泌。該BBB晶片也清楚地表明，在3D網絡中的HA可以在內皮基底側的多孔膜下方以較高的AQP4和α-突觸核蛋白（α-syn）表達來擴展其末端信號。
腦特異性內皮屏障功能
腦血管內皮是具有複雜運輸機制的高度專業化的網絡。BBB內皮的關鍵屏障功能以BBB特異性蛋白的高表達為特徵，包括連接蛋白、轉運蛋白和受體蛋白，以及高跨內皮電阻（transendothelial electrical resistance， TEER）（即低滲透性）。此外，特定人類細胞來源的應用增強了體外模型與BBB內皮的獨特特性的生理相關性。
在目前的研究中需要首先證明，與其他BBB細胞（即星形膠質細胞和周細胞）一起培養時，大腦特異性內皮細胞表現出代表性的基因表達增加，包括調節接頭形成，載體介導的轉運，主動外排和澱粉樣β（Aβ）轉運。
尤其是，BBB細胞相互作用上調了代表性連接蛋白（如occludin（OCLN），zonula occludens-1（ZO-1）和血管內皮鈣粘蛋白（VE-cad））的內皮基因表達和代表性膜。也包含轉運蛋白和受體包括葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1），膽固醇外流調節蛋白（CERP; ATP結合盒亞家族A成員1，ABCA1）和低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1）。
減少3D培養的星形膠質細胞的反應性神經膠質增生
血管內皮屏障功能不僅對於開發和驗證體外BBB模型很重要，而且血管周圍區域提供的生理相關性對於精確概括BBB的結構和功能也至關重要。重建血腦屏障的一個困難而重要的因素是保持健康星形膠質細胞的形態和生理特徵。據報導，星形膠質細胞可在3D培養系統中恢復其體內類似的生理特性，例如形態和功能反應性。
在二維Matrigel塗層表面上培養的HA是平坦的和多邊形的。但是，在3D Matrigel中培養的HA表現出更多的體內樣分叉形態。此外，大多數以3D培養的HA均具有小細胞體，且放射狀分布著細而長的分支，而以2D培養的HA則具有較大的細胞體，且過程少而短。
對在病理條件下上調的反應性神經膠質標記物的基因表達進行了定量分析，以支持我們的BBB晶片中3D培養的HA與常規2D培養系統在生理上的相關性更高。特別是，LCN2通過介導損傷中的促炎反應在神經炎症中起重要作用。與2D培養相比，在3D培養的HA中反應性神經膠質沉著標記，波形蛋白（VIM）和LCN2被下調，而星形膠質細胞標記神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的水平卻沒有顯著變化。
與2D一樣，在3D培養中，用IL-1β進行炎症性細胞因子治療，LCN2表達水平可以進一步以劑量依賴性方式進行調節。這些結果證明了在BBB晶片中3D培養的HA的生理相關性，並表明了在諸如神經炎症等反應性星形膠質增生模型中的潛在應用。
BBB晶片中aquaporin-4的極化表達
血管周間隙中的星形膠質細胞在其末梢過程中通過水通道蛋白AQP4調節大腦中的水穩態。因此，AQP4在星形細胞末端過程中的定位對於在穩態和生理條件下概括血腦屏障很重要。
該BBB模型概括了HAs沿其分支表達的複雜3D網絡，而2D培養模型顯示星形膠質細胞質膜中擴散表達的AQP4。通過計算沿星形膠質細胞末端腳標記的AQP4在血管側通道與實質周側的比例在AQP4極化上進行了分析，並證明了與α-syn的共定位。
在模型中，AQP4的直接錨定將AQP4極化控制到星形細胞末端。用HBMECs和HBVPs培養時，HAs中AQP4的定位極化到通道血管側的星形膠質細胞末端。如先前在體內觀察到的，在存在HBVP的情況下，AQP4的極化分布被顯著誘導。這一發現表明，模型可以模擬BBB的水傳輸系統，該系統負責離子和水在大腦中的穩態。
晶片上的納米顆粒傳輸分析
使用微流技術將載脂蛋白A1（eHNP-A1）設計成HDL模擬納米顆粒，從而將生理相關的大小和組成重構為盤狀HDL）。靜脈注射螢光染料標記的eHNP-A1後，我們通過一項生物分布研究證實，eHNP-A1可以進入BBB，其在大腦中的相對積累約為3％。對冷凍切片的腦組織的共聚焦成像分析證實，全身施用的eHNP-A1位於細胞核周圍。然後，我們在BBB處的血管和血管周間隙中量化了eHNP-A1的分布，並以受控方式研究了轉運機制。我們假設當將NP解決方案引入BBB晶片時，NP要麼保留在血管通道中，要麼與HBMEC相互作用，要麼轉入血管周圍通道，NP可以在其中與HBVP或HAs相互作用。
根據動物研究顯示的eHNP-A1的BBB滲透結果，我們使用BBB晶片研究了eHNP-A1進入大腦的機制。
結果表明，阻斷SR-B1活性可降低HBMECs對eHNP-A1的攝取，而它可能誘導其他受體或內皮細胞吞噬決定因子（如SNAREs42,44）的補償性上調。同時，阻斷脂質轉運蛋白1（BLT-1）的處理使進入組織（EC攝取和血管周通道）的eHNP-A1量減少了約3倍。
總結
該組提出了一種具有生理相關結構和功能的微工程化人體BBB平臺，將其應用於中樞神經系統藥物遞送系統的定量評估。
此BBB模型允許進行多種分析，包括TEER測量，納米顆粒採樣和FACS分析，而同時通過多針架調節多個設備。
在保留微型器官晶片工程技術優勢的同時集成多個設備的微流體並行化技術將進一步提供更高通量的系統。
我相信在未來，人類BBB模型可以為轉化醫學研究提供廣泛有用的工具，尤其是對神經系統疾病中的神經炎症和反應性神經膠質增生建模。
引用
Ahn, S.I., Sei, Y.J., Park, HJ. et al.Microengineered human blood–brain barrier platform for understanding nanoparticle transport mechanisms. Nat Commun11, 175 (2020). DOI: 10.1038/s41467-019-13896-7