長鏈非編碼(long non-coding RNAs ,lncRNAs)現如今在癌症的發生發展中是一個研究熱點,最常見的作用方式是通過海綿結合miRNAs發揮作用。在大多數的研究中,通常是已知研究lncRNAs,通過生物信息學篩選、二代測序等方式,尋找能夠海綿結合的miRNAs;而今天解讀的這篇文獻,是通過已知研究的miRNAs,尋找能夠海綿結合的lncRNAs。
篩選和鑑定與肝癌耐藥相關的候選miRNA
該研究採用TRAIL非耐藥肝癌細胞株HepG2S和Bel-7402S,以及TRAIL耐藥肝癌細胞株HepG2R 和Bel-7402R進行研究。首先使用MTT試驗驗證了耐藥細胞株的HepG2R 和Bel-7402R耐藥性(圖1A)。
緊接著,由於TRAIL誘導的細胞凋亡是以caspase依賴的方式進行的,因此,在上述四株細胞株中,檢測了CASP8和CASP3的mRNA和蛋白的表達情況,結果表明兩者的表達量在耐藥細胞株中均下調(圖1B-C)。
為了研究其中的耐藥機制,該研究使用在線工具(Targetscan,RNA22,miRWalk和Starbase)搜索可能調控caspase 3或caspase8的候選miRNA。結合GEO資料庫,選擇耐藥腫瘤細胞中的非下調miRNA (圖1D)。在篩選出的這些miRNA中,通過構建mimic過表達模型發現,對caspase8下調力度最強的是miR-24-3p,對caspase 3下調力度最強的是miR-221(圖1E-F)。
MiR-24/miR-221促進肝癌細胞對TRAIL的抗性
選取上述研究中選取的miR-24和miR-221,通過構建過表達和敲降的細胞模型,採取Q-PCR、流式細胞術等實驗,證明miR-24和miR-221促進肝癌細胞對TRAIL的抗性(圖2)。
MiR-24/miR-221通過直接靶向負性調控caspase8/3
為了進一步確證miR-24/miR-221對caspase 8/3的調控作用,本部分研究採用了螢光素酶報告基因試驗、和Western blot實驗,證明了miR-24/miR-221通過直接靶向負性調控caspase 8/3(圖3)。
抑制CASC2能促進TRAIL抗性
前期的研究報導證明,在肝癌中CASC2能抑制肝癌的增殖。因此,該研究在耐藥細胞株HepG2R 和Bel-7402R中敲降CASC2,使用MTT實驗和流式細胞術,證明敲降CASC2能夠抑制細胞的TRAIL抗性(圖4)。
CASC2通過直接靶向對miR-24和miR-221進行負調控
通過miRCode預測顯示,CASC2與 miR-24/miR-221有直接作用的位點,因此,該研究設計了螢光素酶報告基因試驗和RIP實驗驗證,並且敲降CASC2後miR-24和miR-221的表達量顯著提高,證明了CASC2通過直接靶向對miR-24和miR-221進行負調控(圖5)。
CASC2通過miR-24/miR-221調節TRAIL抗性
該部分實驗通過在耐藥細胞株HepG2R 和Bel-7402R中敲降CASC2和/或miR-24/miR-221進行營救實驗,使用MTT試驗和流式細胞術,證明了CASC2通過miR-24/miR-221調節TRAIL抗性,並且通過Western blot實驗驗證了CASC2/ miR-24/miR-221對caspase 8/3的調控作用(圖6)。
總結
該研究是一項比較經典的lncRNA/miRNA/蛋白對於癌症的調控作用的研究,不過該研究的出發點是蛋白(caspase 8/3),隨後找到調控蛋白的miRNA(miR-24/miR-221),最後找到調控miRNA的lncRNA(CASC2),完成了這一調控路徑。這種逆向的研究思路,或許值得大家借鑑一下。