《自然醫學》: 賓大科學家發現CAR-T治療後復發的罕見機制

我們對CAR-T細胞治療的認知又要被刷新了。

來自賓夕法尼亞大學醫學院的J. Joseph Melenhorst和免疫治療學大牛Carl H. June團隊，在頂級期刊《自然醫學》上發表了一個令人震驚的CAR-T細胞治療後復發的臨床案例^[1]。

在給一名身患復發/難治性B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）的患者生產CAR-T細胞時，那個本該加到T細胞上，幫助T細胞特異性識別CD19、並抓住癌細胞的CAR（嵌合抗原受體），意外地被加到患者癌變的B細胞上，形成了「CAR-癌細胞」。

更讓研究人員震驚的是，加到癌細胞上的CAR會與癌細胞表面的CD19結合，讓CAR-T細胞失去了識別癌細胞的靶標。這名患者在接受CAR-T治療的261天之後，由於「CAR-癌細胞」大量增殖，癌症復發；最終死於與白血病相關的併發症。

這個研究不僅報告了一個之前從沒有遇見過的CAR-T治療風險；也直接證明了癌症幹細胞存在於人體的假說，因為研究人員發現導致患者死亡的CAR-癌細胞，都來自於同一個被編輯的癌細胞。

實際上，這是Carl H. June團隊在短短4個月之內報告的第二個罕見CAR-T治療病例了。

早在今年5月31日，June團隊《自然》雜誌上發表一篇論文稱，他們在給一名患者製作CAR-T時，有一個CAR序列被無意插入到了TET2基因中，導致了該基因功能障礙^[2]。

正是這個意外地插入，賦予了這個CAR-T細胞超能力，讓它增殖能力更強、抗癌能力更強、活得也更久。最終在這個TET2被插入失活的CAR-T幫助下，那名慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者的病情得到了長期的控制，截止論文發稿時，那名患者已經生存了5年。

與4個月之前的那個78歲的患者相比，本次研究匯報的這名20歲的患者就沒那麼幸運了。

這名20歲的B-ALL患者，在做完第三次化療和臍帶血移植之後，病情又復發了。走投無路之下，他參與了賓大組織的CAR-T（CTL019）細胞治療I期臨床研究（NCT01626495）。

醫務人員從他身上獲取T細胞，並製作成CTL019細胞。在接受淋巴清除之後，患者被注射了20億個T細胞，其中有治療作用的CTL019細胞有4.8億個。

CTL019細胞回輸的28天之後，患者的病情就完全緩解了，不得不說CAR-T的威力還是很厲害的。

在回輸後的第252天，研究人員例行檢查患者外周血中CTL019細胞數量的時候，基因測序結果表明，外周血中的CAR在暴增。奇怪的是，當他們用流式細胞技術在外周血中找CAR-T的時候，卻沒發現CAR-T有增多的跡象。

基因檢測CAR裡面的4-1BB含量走勢；

以及流式細胞術檢測CAR-T細胞含量走勢

在血液中檢測到了大量的CAR基因，卻沒有發現CAR-T。這種現象讓研究人員感到困惑。

到回輸後的261天時，患者疾病突然復發，分析發現導致患者病情復發的癌細胞，90%檢測不到CD19。

當研究人員再去檢查那些攜帶CAR的「T細胞」時，他們看到了讓他們震驚的結果：那些攜帶CAR的細胞，竟然不是T細胞，竟然是癌變的B細胞。

反應過來的研究人員迅速制定了新的治療方案。遺憾的是，他們最後沒能阻止「CAR-癌細胞」的腳步，患者最終死於白血病相關的併發症。

攜帶CAR的癌細胞究竟是從哪裡來的？他們與患者的病情復發又是啥關係？

通過給CAR-癌細胞測序，及分析患者一直以來的回輸數據，研究人員最終確定，癌變B細胞裡的CAR是製作CTL019細胞時意外引入的。而且起始的那個癌細胞裡面整合進去了兩個CAR，一個在PCCA基因的第18個內含子裡，另一個插在NRP1基因下遊62.5kb處。不過，這兩種不同的插入方式，均沒有影響這兩個基因的表達。說明，這兩種插入方式與患者的癌症復發應該是無關的。

當研究人員回過頭在製備好的CTL019細胞裡面尋找時，並沒有找到有上述兩種特徵的細胞存在。這表明，初始的「CAR-癌細胞」含量是非常非常少的，以至於現有手段不能檢測。

進一步的研究也證實，所有的「CAR-癌細胞」都來擁有同一個祖先。也就是說，患者體內的所有「CAR-癌細胞」都是那唯一一個被編輯的癌變B細胞增殖來的。

CAR基因序列在癌變B細胞中插入的位置

研究人員是先觀察到患者體內CAR異常高表達，然後發現CD19陰性的癌細胞大量增殖。這二者之間是否存在什麼關係，CTL019的靶標CD19又究竟去哪裡了？

之前有研究表明，癌細胞表面的CD19的缺失，可能是CD19發生了突變^[3]，或者可變剪切[3]，或者是B細胞受體覆核蛋白CD81發生突變^[4，5]導致的。不過，研究人員在患者體內並沒有發現上述現象。

這就奇怪了。

更奇怪的是，在mRNA水平居然發現了CD19。這暗示CD19可能還在細胞表面，只是因為某種原因，用流式細胞儀發現不了了。於是研究人員就想到了一種靶向CD19細胞內部分的抗體OTI3B10。通過免疫組織化學染色，研究人員確實發現，在導致患者白血病復發的CD19「陰性」癌細胞上，確實存在CD19。

此時，謎底呼之欲出。大概率是癌細胞表達的CAR與癌細胞表面的CD19自行結合了，把CD19遮住了。為了證實這一猜想，研究人員使用結合CAR和CD19 的兩種特異性抗體，結合共聚焦顯微技術，發現CAR和CD19確實是在一起的。難怪流式細胞術檢測不到細胞表面的CD19。

實際上，不僅流式細胞術難以發現這種CAR-癌細胞，連靶向CD19的CAR-T也難以發現CAR-癌細胞了。也就是說，癌變的B細胞意外獲得了對CAR-T的耐藥性。

癌變的B細胞自己獲得了CAR，隨便把CD19遮擋了，CAR-T沒機會識別癌細胞了

為了進一步確定這個結果，研究人員重新人為讓癌變的B細胞表達CAR，再次證實癌細胞表達的CAR確實會與自身的CD19結合，阻擋了CAR-T對癌細胞的識別。同時研究人員還證實，這種遮蔽現象不僅僅是CD19特有的，CD22也會出現這種現象。這意味著這種對CAR-T治療的抗性，可能是所有CAR-T治療都要面對的問題。

在發現這個現象之後，研究人員迅速分析了全球範圍內接受CTL019治療的所有369例患者的數據，幸運的是，在其他患者體內沒有發現這種超級「CAR-癌細胞」的出現。

最後，這個臨床案例還讓研究人員在人體內證實了一個假說：癌症幹細胞假說。因為通過分析所有的數據發現，導致這名患者癌症復發的癌細胞，來自於同一個被意外加上CAR的癌變B細胞。即，一個超級癌細胞就能足以產生致命的癌症^[6]。

把5月份的研究和這個研究放在一起看，不難發現CAR-T的製作仍舊充滿了不確定。有可能因為分離的T細胞不純，導致「CAR-癌細胞」出現；也有可能因為脫靶問題，CAR插到了其他的位點。

這些都足以讓CAR-T製造企業提高警惕，在插入CAR的時候儘可能地清除癌細胞，降低脫靶效應。

幸或不幸，上述研究都在推動CAR-T變得更好。

參考資料：

[1].Marco Ruella, Jun Xu, David M. Barrett, et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell[J]. Nature medicine, 2018.

[2].Fraietta J A, Nobles C L, Sammons M A, et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells[J]. Nature, 2018: 1.

[3].Sotillo E, Barrett D M, Black K L, et al. Convergence of Acquired Mutations and Alternative Splicing of CD19 Enables Resistance to CART-19 Immunotherapy[J]. Cancer Discovery, 2015, 5(12): 1282-1295.

[4].Van Zelm M C, Smet J, Adams B, et al. CD81 gene defect in humans disrupts CD19 complex formation and leads to antibody deficiency.[J]. Journal of Clinical Investigation, 2010, 120(4): 1265-1274.

[5].Braig F, Brandt A, Goebeler M, et al. Resistance to anti-CD19/CD3 BiTE in acute lymphoblastic leukemia may be mediated by disrupted CD19 membrane trafficking[J]. Blood, 2017, 129(1): 100-104.

[6].https://www.nytimes.com/2018/10/01/health/leukemia-immunotherapy-kymriah.html