點評 | 惠恩夫（加州大學聖地牙哥分校）、趙陽兵（賓夕法尼亞大學）
責編 | 兮
CAR-T療法是通過在患者自身T細胞上表達嵌合型抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR），使其在體內識別並殺傷腫瘤細胞的一種腫瘤免疫療法。CAR-T療法已在血液癌中展現出令人矚目的療效，並批准用於治療急性B淋巴細胞白血病以及特定類型的非霍奇金淋巴瘤。
然而作為一種新的療法，CAR-T治療也有其局限性。越來越多的臨床數據顯示，高達30%-50%的CAR-T療法治療的患者會出現腫瘤復發現象，並且其中大多數病人會在接受CAR-T治療後一年內出現復發。
導致腫瘤的復發原因有多種，其中CAR-T細胞的體內持續能力（in vivo persistence），即CAR-T細胞在患者體內存活時間的長短，是一個決定性的因素【1,2】。在急性淋巴細胞白血病以及慢性淋巴細胞白血病臨床研究中都發現，CAR-T療法的療效和CAR-T細胞的體內持續能力呈正相關性【3】。
因此，探索CAR-T細胞的體內持續能力的調控機制已成為當下的研究熱點。
2020年8月5日，上海科技大學王皞鵬研究團隊與中科院分子細胞科學卓越創新中心許琛琦實驗室，以及復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院吳海濤課題組合作在Immunity上發表了題為Chimeric Antigen Receptor Designed to Prevent Ubiquitination and Downregulation Showed Durable Antitumor Efficacy 的研究論文，通過研究CAR受體蛋白在CAR-T細胞中運輸降解的調控機制，設計了一種新型的可循環CAR，顯著地提高了CAR-T細胞的體內持續能力和抗腫瘤效果，為防止CAR-T治療後腫瘤的復發提供了新策略。
已有研究表明，抗原的結合往往會引起抗原受體的內吞和降解，這是調控免疫細胞活性的一種機制【4】。CAR作為一種人工設計的抗原受體是否有同樣的現象呢？
為了探索這個問題，研究團隊通過小鼠腫瘤模型，比較了下面兩種環境中CAR-T細胞的表面CAR的表達：高腫瘤抗原表達的腫瘤微環境和無腫瘤抗原表達的外周淋巴器官（圖1）。
研究發現相比於外周淋巴器官中CAR的正常表達，腫瘤微環境中高表達的腫瘤抗原會導致CAR受體的顯著下調，從而抑制CAR-T細胞的抗腫瘤能力。
圖1 腫瘤微環境中CAR-T細胞表面CAR受體表達顯著下調
研究團隊進一步研究了CAR受體下調的分子機制發現：靜息的CAR-T細胞上，CAR受體們並不是靜止不動的，而是不停的被內吞(internalization)，內吞的CAR受體又會被送回細胞表面（recycling），從而達到一個動態平衡；當腫瘤抗原出現時，這種穩態會被打破。
腫瘤抗原的結合導致CAR受體蛋白的快速泛素化，導致內吞的CAR受體不再回復到細胞表面，而是輸送到溶酶體（lysosome）進行降解, 致使CAR受體的下調。
為了阻斷這個過程，研究團隊把CAR受體胞內的泛素化位點賴氨酸K突變成精氨酸R（CARKR），從而阻斷了CAR泛素化以及後續的溶酶體降解。CARKR無法被降解，CARKR可以更多的返回到CAR-T細胞表面，因此研究團隊將這種全新的設計命名為可循環CAR（Recyclable CAR）。
圖2 腫瘤抗原介導CAR下調的分子機制
可循環CAR有2個特點：1. 由於抗原介導的CAR下調被抑制，可循環CAR能夠長時間的保持CAR的表達，從而具備長效的殺腫瘤能力（圖3A）；2. 若把可循環CAR的設計方案應用到現在臨床批准的CD19-41BB CAR上，可以大幅度增強其體內持續能力。
當把同樣數量的野生型CAR-T和可循環CAR-T細胞輸入荷瘤小鼠，可循環CAR-T細胞在體內存活的更好，40天後其數量是野生型CAR-T細胞的100倍左右（圖3B）。這些都賦予了可循環CAR-T細胞強大的抗腫瘤效果（圖3C）。
圖3 可循環CAR-T細胞的療效
進一步研究發現由於激活的可循環CAR沒有降解，大量聚集在胞內內體（endosome）中。而此時CAR胞內段的4-1BB結構域仍然結合著傳遞4-1BB信號的TRAF2分子，形成了可以在胞內繼續傳遞信號的信號小體（signalosome）（圖4）。
4-1BB的下遊信號隨之被增強，進而促進T細胞代謝重編程（提高線粒體的生成及氧化磷酸化代謝），以及促進中央型記憶T細胞的分化和T細胞的體內存活/增殖能力。
值得一提的是，這是領域首次觀察到CAR受體可以在T細胞中內體上進行信號轉導（Endosomal CAR signaling）, 這將幫助我們更好地認識CAR信號轉導的分子機制，為將來CAR設計的優化提供新的思路。
圖4 可循環CAR形成更多的signaling endosomes
綜上所述，該研究發現腫瘤抗原可以引起CAR泛素化以及溶酶體介導的CAR降解，導致細胞表面CAR受體的下調。通過阻斷CAR泛素化，新型的可循環CAR設計可以有效地增強CAR-T細胞的長效殺腫瘤活性，同時大幅度地提高CAR-T細胞體內持續能力，從而增強其抗腫瘤的療效。
重要的是，可循環CAR的設計方案僅需在原有CAR分子的胞內區引入幾個胺基酸的突變，對於識別腫瘤的胞外區以及穩定CAR表達的穿膜區保持不變。因此，可循環CAR的設計為現有的靶向各種腫瘤的CAR-T療法提高療效，防止復發，提供了一種簡單易行而廣譜的解決方案。
專家 · 點評
惠恩夫 （UCSD，助理教授）
作為免疫系統抗腫瘤的「戰士」，T細胞依靠其表面抗原受體（T cell receptor，簡稱TCR）識別腫瘤抗原，進而通過下遊的信號分子激活T細胞，分泌細胞毒素和細胞因子，從而殺死腫瘤細胞。然而，很多腫瘤由於無法被天然的TCR有效識別 ，而得以逃逸免疫系統的攻擊。為了解決這個問題，人們利用基因工程技術為T細胞裝上嵌合型抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, 簡稱CAR）。這些受體的胞外端是一段可以識別腫瘤抗原的結構域，胞內端通常包含TCR的CD3活化基序和共刺激受體（CD28，4-1BB等）的活化基序。改裝後的T細胞(CAR-T)可以更有效的識別並消滅腫瘤細胞。儘管CAR-T療法對於血液系統惡性腫瘤已經取得了顯著效果，但也有明顯的缺陷。比如有些病人對CAR-T療法沒有響應；而且即使在應答較好的B細胞淋巴瘤病人中，有接近50%的應答病人會在一年內復發。在這些復發的病人中，CAR-T細胞數量大大減少或者失去功能，其背後的原因並不清楚。因此，增強CAR-T療法的持續性是當前免疫療法的一個關鍵問題。王皞鵬/許琛琦/吳海濤團隊的這篇發表在IMMUNITY雜誌的出色工作，令人信服地揭示了限制CAR-T持續性的關鍵機制——CAR的泛素化（ubiquitination）。基於該機制，作者進而突變了CAR上的泛素化位點，設計出一種穩定持久的CAR， 並且在老鼠腫瘤模型中證明這種新式CAR可以大大增強CAR-T的抗腫瘤能力並延長CAR-T細胞在體內的壽命。這一成果有望簡潔高效改進CAR-T療法，解決免疫療法中的一個重大問題。類似於細胞上的很多受體，人工合成的CAR不僅存在於細胞表面，還可以被內吞（endocyse或internalize）到內膜上，然後通過膜運輸（membrane trafficking）再次回到細胞表面，這個被稱為循環回收（recycling）的過程可以動態調節CAR在細胞表面的表達量。另有體外研究表明，CAR-T和腫瘤細胞結合之後，CAR在細胞表面的表達量會降低，進而削弱CAR-T攻擊腫瘤細胞的能力。但這種現象的生理意義有待確認。另外，腫瘤細胞降低CAR表達量的機制還不清楚，內吞作用是否是唯一的途徑尚不得而知。王皞鵬等的這篇IMMUNITY論文證明，CAR在結合腫瘤抗原後會很快被泛素化，這些被泛素化的CAR會被送到溶酶體（lysosome）降解，進而阻斷內吞CAR回到細胞表面。作者接著證明，將CAR上的泛素化位點賴氨酸（K)突變成精氨酸（R)就可以抑制CAR的降解，提高內吞CAR返回細胞表面的機率，進而增強CAR-T殺傷腫瘤細胞的能力。他們將這種無法被泛素化的CAR命名為可循環CAR(recyclable CAR)。令人驚喜的是，在小鼠模型中，帶有這種recyclable CAR的T細胞可以完全清除普通CAR-T無法清除的K562血癌細胞。作者進一步發現，除了更強的殺傷能力，含有recyclable CAR的T細胞在體內有更強的持久性，因為它們比普通CAR-T增殖更快，更容易形成「長壽」的記憶性（memory）T細胞。分子機制上，recyclable CAR能夠特異性地增強4-1BB/TRAF2/NF-kB共刺激信號通路，但對CD3/ZAP70信號通路影響很小。有的是，相比於普通的CAR-T細胞，recyclable CAR-T胞內有更多含有4-1BB/TRAF2複合體的內體（endosome），證據表明這些內體放大了4-1BB信號通路，進而增強CAR-T的代謝能力和線粒體功能。這也是國際上首次關於CAR可以在內體繼續傳導信號的報導。綜上所述，該項研究通過生化手段發現了導致CAR降解和限制CAR-T持續性的基本機制，並在此基礎上設計出一種新型的抗降解CAR，進而在動物模型中證明新型CAR-T具有更強大而持久的抗腫瘤能力。這項令人印象深刻的工作再次證明基礎研究的重要性和其對免疫療法的指導意義。該項研究發現也啟發了一些新的思考：01研究廣泛的K48位的多聚泛素化通常導致蛋白酶體（proteasome）介導的降解，但該研究證明泛素化的CAR是通過溶酶體降解的。那麼CAR的泛素化是什麼類型？由什麼泛素連接酶E3介導？這個E3可否作為改善CAR-T功能的靶標？02先前的研究發現少數受體（例如NGF）可以通過內體上的受體進行信號轉導(endosomal signaling)。文中證據顯示內體信號對4-1BB CAR-T功能的重要性；然而內體信號對於其他種類的CAR-T功能的重要性仍不得而知。03臨床上，CAR-T療法目前對於實體瘤的效果不明顯，而CAR-T細胞在病人體內不能長時間的存活也是局限CAR-T治療實體腫瘤的因素之一。可否利用文中提出的recyclable CAR來改進對實體瘤的療效？這些問題的答案有待進一步研究揭曉。
趙陽兵 (賓夕法尼亞大學，副教授)
CAR-T細胞治療對於多種B細胞惡性腫瘤具有良好的療效。2017年，兩款以CD19為靶點的CAR-T細胞產品獲批上市。各種針對其他適應症的CAR-T臨床實驗也正在如火如荼的進行中。然而，大量臨床數據表明，有相當一部分患者在接受CAR-T細胞治療後發生腫瘤免疫逃逸現象，導致復發或治療無效。腫瘤細胞可採用多種方式逃避CAR-T細胞的攻擊。例如，腫瘤微環境抑制CAR-T細胞的活性或者導致CAR-T細胞耗竭。同時，腫瘤細胞也可以通過丟失CAR-T細胞所識別的腫瘤抗原來達到免疫逃逸。因此，理解腫瘤細胞在腫瘤微環境如何與CAR-T細胞進行相互作用並完成免疫逃逸可以提高CAR-T治療效果及幫助我們解決CAR-T治療後腫瘤復發的問題。上海科技大學王皞鵬研究團隊與中科院分子細胞科學卓越創新中心許琛琦實驗室，以及復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院吳海濤課題組合作研究發現了一種腫瘤免疫逃逸的新機制。在腫瘤微環境中存在著大量的腫瘤抗原，不停的刺激CAR-T細胞，導致CAR-T細胞表面CAR受體大量下調。CAR表達的下調導致CAR-T細胞腫瘤殺傷能力受損，抑制CAR-T細胞體內的存活和增殖，從而引發了腫瘤細胞的免疫逃逸。針對這個機制，研究團隊設計了一個新型的抵抗CAR表達下調的「可循環CAR」。研究表明受體的泛素化往往介導受體激活後的下調和降解，阻斷受體的泛素化可以減低受體的下調和降解。可循環CAR的本質是一種無法被泛素化的CAR。在體外實驗中，可循環CAR-T細胞比野生型的CAR-T細胞有更強的腫瘤殺傷能力。在小鼠實體腫瘤模型中，野生型的CAR-T由於免疫逃逸，無法清除腫瘤；相比野生型的CAR-T細胞，可循環CAR-T細胞在小鼠體內增殖/存活的更好，並且形成更多記憶T細胞，從而可以有效的清除腫瘤。這些實驗數據為驗證可循環CAR-T療效的臨床實驗提供了堅實的基礎。
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參考文獻
1. Maude, S.L., Laetsch, T.W., Buechner, J.,Rives, S., Boyer, M., Bittencourt, H., Bader, P., Verneris, M.R., Stefanski,H.E., Myers, G.D., and Qayed, M. (2018). Tisagenlecleucel in Children and YoungAdults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. 378, 439-448.
2. Park, J.H., Riviere, I., Gonen, M., Wang,X., Senechal, B., Curran, K.J., Sauter, C., Wang, Y., Santomasso, B., Mead, E., et al. (2018). Long-Term Follow-up ofCD19 CAR Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia.N Engl J Med378, 449-459.
3. Porter, D.L., Hwang, W.T., Frey, N.V.,Lacey, S.F., Shaw, P.A., Loren, A.W., Bagg, A., Marcucci, K.T., Shen, A.,Gonzalez, V., et al. (2015). Chimericantigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsedrefractory chronic lymphocytic leukemia.Science translational medicine7, 303ra139.
4. Liu, H., Rhodes, M., Wiest, D.L.,and Vignali, D.A. (2000). On the dynamics of TCR:CD3 complex cell surfaceexpression and downmodulation.Immunity13, 665-675.