結構生物學裡程碑:低溫電子顯微鏡技術時代來臨

　　X射線晶體衍射技術(X-RAY CRYSTALLOGRAPHY)即將成為歷史，低溫電子顯微技術(CRYO-ELECTRON MICROSCOPY)引起了揭示細胞內隱秘機制的革命。

　　在劍橋大學一幢建築的地下室裡，一場技術革命正在醞釀。

　　一個笨重的、大約3米高的金屬盒子通過連接細胞的橙色纜線，安安靜靜地傳輸著以萬億字節計算的數據。這是世界上最先進的低溫電子顯微鏡之一：低溫電子顯微鏡通過電子束對冷凍的生物分子進行成像，從而得到分子的三維結構。站在這個耗資770萬美金的儀器旁，英國醫學研究委員會分子生物學實驗室(UK Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, LMB)的結構生物學家 Sjors Scheres表示，低溫電子顯微鏡非常敏感，一聲喊叫就會帶來極大誤差，導致實驗失敗。「英國需要更多低溫電子顯微鏡，因為未來它會成為結構生物學的主流。」

　　低溫電子顯微鏡震驚了結構生物學。過去30年裡，低溫電子顯微鏡揭示了核糖體、膜蛋白和其它關鍵細胞蛋白的精細結構。這些發現都發表在頂級雜誌上。結構生物學家們表示，毫不誇張地說，低溫電子顯微技術正處於革命之中：低溫電子顯微鏡能夠快速生成高解析度的分子模型，這一點遠超X射線晶體衍射等方法。依靠舊方法獲得諾獎的實驗室也在努力學習這一技術。這種新模型能夠準確地揭示細胞運行的必要機制，以及如何靶向針對疾病相關的蛋白。

　　「低溫電子顯微鏡能夠解決很多以前無法解決的謎題。」舊金山加利福利亞大學(University of California)的結構生物學家David Agard這樣說道。

　　幾年前Scheres被招進LMB，任務是幫助改進低溫電子顯微鏡，最終他成功了。上個月，他們發表了這個領域最令人振奮的成就：阿茲海默症相關的酶的高清圖片，圖片包括該酶的1200左右個胺基酸，解析度達到零點幾納米。

　　生物學家們如今仍在努力發展該技術，以期用它解決小分子或可變形分子的精微結構——這對低溫電子顯微鏡來說，也是一大挑戰。來自加利福利亞大學(University of California)的結構生物學家Eva Nogales表示，叫它革命也好，飛躍也好，低溫電子顯微鏡的確打開了一扇大門。

　　蛋白結晶

　　結構生物學領域有一條不成文的觀點：結構決定功能。只有知道生物分子的原子排布，研究者們才能了解這個蛋白的功能。例如，核糖體是如何根據mRNA的序列來製造蛋白，分子孔道是如何開和關的。幾十年來，分析蛋白結構有一個無冕之王——X射線晶體衍射。在X射線晶體衍射中，科學家們讓蛋白結晶，接著利用X射線照射，隨後根據X射線的衍射來重建蛋白的結構。在蛋白質數據銀行(Protein Data Bank)的100,000多條蛋白詞目裡，超過90%的蛋白結構是利用X射線晶體衍射技術解析得到的。很多諾貝爾獎也與這一技術相關，例如1962年揭示DNA雙鏈螺旋結構的諾獎。

　　儘管X射線晶體衍射一直是結構生物學家的最佳工具，但是它有較大的限制。科學家們可能需要幾年才能找到把蛋白形成大塊結晶的方法。而很多基礎蛋白分子，例如嵌在細胞膜上的蛋白，或是形成複合體的蛋白卻無法被結晶。

　　當Richard Henderson 1973年到LMB，研究菌視紫紅質(一種利用光把質子運進膜內的蛋白)結構時，X射線晶體衍射是首選工具。Henderson和他的同事Nigel Unwin成功地做出了該蛋白的二維結晶，但卻不適用於X射線衍射。因此他們決定使用電子顯微鏡。

　　當時，電子顯微鏡主要用於研究用重金屬染過色的病毒或組織切片。一束光子打在樣本上，新生的電子被檢測到，被用於解析樣本結構。這種方法成功製作了第一幅病毒的精微圖片——一種菸草病毒。但染色導致無法看清各個蛋白，更不要說原子細節了。Agarad表示，樣本上要麼滿是斑點，要麼沒染上，你只能看到分子的輪廓。

　　Herderson等人省略了染色的步驟，把菌視紫紅質的單層晶體放到金屬網格中，然後用電子顯微鏡進行成像。Agard表示，這個過程裡，你看到的是蛋白的原子。這在當時是很大的進步，因為當時人們都認為不可能利用電子顯微鏡解析蛋白結構。Henderson等人在1975年發表了這一成果。

　　20世紀80年代和90年代，低溫電子顯微鏡領域發展迅速。一個關鍵性突破是利用液態乙烷來快速冷凍蛋白溶液。這也是為什麼叫低溫電子顯微鏡的原因。但這個技術的解析度僅為1納米，遠遠達不到針對蛋白結構進行藥物設計的需求。而當時X射線晶體衍射的解析度能達到0.4納米。NIH等資助者投入了數億美金來支持蛋白晶體領域的發展，但對於低溫電子顯微鏡領域的資助卻很少。

　　1997年，Henderson參加了高登研究會議(Gordon Research Conference )關於3D電子顯微鏡的年會。一位同事以這樣的話做為開幕致詞，「低溫電子顯微鏡技術非常有限，不可能超越X射線晶體衍射。」 但Henderson的想法完全不同，在下一場發言中，他做出了反擊。Henderson指出，低溫電子顯微鏡會超越其它各種技術，成為全球研究蛋白結構的主流工具。

　　革命由此開始

　　在此之後，Henderson等人致力於提高電子顯微鏡的性能——尤其是感知電子的靈敏度。在數位相機席捲全球很多年後，很多電子顯微鏡學家仍然傾向於使用傳統的膠片，因為比起數碼感應器，膠片能更有效地記錄電子。與顯微鏡生產商合作時，研究者們發明了一種新的直接電子探測器，這種探測器的靈敏度遠高於膠片和數位相機探測器。

　　大約在2012年，這種探測器能夠以一分鐘幾十幀的高速得到單個分子原子的連續圖像。同時，和Scheres一樣的研究者們精心編寫了將多張2D圖片建成3D模型的軟體程序。這些3D圖像的畫質可以媲美X射線晶體衍射獲得的圖像。

　　低溫電子顯微鏡適用於研究大的、穩定的分子，這些分子能夠承受電子的轟擊，而不發生變形——由多個蛋白組成的分子機器是最好的樣本。因此由RNA緊緊圍繞的核糖體是最佳的樣本。三位化學家用X射線晶體衍射研究核糖體溶液的工作在2009年獲得了諾貝爾化學獎，但這些工作花了幾十年。近幾年，低溫電鏡研究者們也陷入了「核糖體熱」。多個團隊研究了多種生物的核糖體，包括人類核糖體的首個高清模型。X射線晶體衍射的研究成果遠遠落後於LMB的Venki Ramakrishnan實驗室，Venki獲得了2009年的諾獎。Venki表示，對於大分子來說，低溫電子顯微鏡遠比X射線晶體衍射要實用。

　　這幾年，低溫電子顯微鏡的相關文章有很多：2015年一年，這個技術就用於100多個分子的結構研究。X-射線晶體衍射只能對單個、靜態的蛋白晶體成像，但低溫電子顯微鏡能夠對蛋白的多種構象進行成像，幫助科學家們推斷蛋白的功能。

　　5月，多倫多大學(University of Toronto)結構生物學家John Rubinstein等人使用了100,000張低溫電子顯微鏡圖片來生成V-ATPase 的「分子電影」，V-ATPase的作用是消耗ATP，把質子運進運出細胞液泡。」我們發現，這個酶非常靈活，可以彎折、扭曲和變型。」 Rubinstein說道。他認為，這是由於這個酶的靈活性，它能夠高效地把ATP 釋放的能量傳遞到質子泵。

　　2013年Nogales的團隊拼接了調控DNA轉錄成RNA的複合體的結構。他們發現，複合體的一個臂上懸掛著緊繞DNA鏈的10納米結構，這段結構可能影響基因轉錄。Nogales表示，這個結構很漂亮，它可以幫助我們分析這個分子起作用的機制。

　　小而漂亮

　　現在低溫電鏡迅猛發展，專家們正在尋找更大的挑戰作為下一個解析目標。對很多人來說，最想解析的是夾在細胞膜內的蛋白。這些蛋白是細胞信號通路中的關鍵分子，也是比較熱門的藥物靶標。這些蛋白很難結晶，而低溫電子顯微鏡不大可能對單個蛋白進行成像，這是因為很難從背景噪音中提取這些信號。

　　這些困難都無法阻擋加利福利亞大學(University of California)的生物物理學家程亦凡。他計劃解析一種細小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是檢測辣椒中引起灼燒感的物質的受體，並與其它痛感蛋白緊密相關。加利福利亞大學病理學家David Julius等人之前嘗試結晶TRPV1，結果失敗。用低溫電子顯微鏡解析TRPV1項目，一開始進展緩慢。但2013年底，技術進步使得這一項目有了重大突破，他們獲得了解析度為0.34納米的TRPV1蛋白的結構。該成果的發表對於領域來說，無異於驚雷。因為這證實了低溫電子顯微鏡能夠解析小的、重要的分子。「當我看到TRPV1的結構時，我激動得一晚上睡不著覺。」Rubinstein說道。

　　研究者們可能面臨更多這樣無眠的夜晚。Agard表示，會有更多膜蛋白相繼被解析出來。

　　上個月由Scheres和清華大學的結構生物學家施一公合作發表的一篇文章就成功解析了一個膜蛋白。他們建立了γ-分泌酶的模型，γ-分泌酶負責合成與阿茲海默症相關的β-澱粉斑。0.34納米解析度的圖譜顯示，比較少見的遺傳性阿爾茨海默病的γ-分泌酶突變後會在圖譜上呈現兩個「熱點」(突變或者重組頻率顯著增加的位點)，並且這種突變最終會合成有毒性的β-澱粉斑。γ-分泌酶的結構圖幫助研究者發現為什麼以往的抑制劑會無效，從而促進新藥的研發。程亦凡表示，γ-分泌酶的結構非常驚人。

　　類似的成功吸引了製藥公司的注意。他們希望藉助低溫電子顯微鏡去解析那些無法結晶的蛋白，從而更好地研發藥物。Scheres如今和輝瑞公司合作，攻克離子通道。離子通道包含很多膜蛋白，例如痛感受分子和神經遞質受體。「我幾乎被每一個人聯繫過。」Nogales這樣說道。

　　儘管低溫電子顯微鏡發展迅速，很多研究者認為，它仍有巨大提升空間。他們希望能製造出更靈敏的電子探測器，以及更好地製備蛋白樣本的方法。這樣的話，就能夠對更小的、更動態的分子進行成像，並且解析度更高。5月，有研究者發表了一篇細菌蛋白的結構，解析度達到了0.22納米。這也顯示了低溫顯微鏡的潛力。

　　與任何熱門領域一樣，低溫電子顯微鏡的發展也有煩惱。一些專家擔心研究者們盲目追求該儀器會誘發一些問題。2013年HIV表面蛋白的結構圖遭到了科學家們的質疑，他們認為用於建模的圖片很多都是白噪聲。此後，其他團隊得到的X射線晶體衍射和低溫電子顯微鏡模型也對原模型提出了質疑。但這些研究者們堅持相信自己的結果。今年6月，在高登研究會議(Gordon Research Conference )上，研究者們希望低溫電子顯微鏡的結構圖要有嚴格的質量控制。並且雜誌要求作者們提供詳細的建模方法。

　　成本問題可能會限制低溫電子顯微鏡的推廣。Scheres估計，LMB每天用於支持低溫電子顯微鏡的經費就達到近3萬人民幣，外加近1萬的電費——這是由於存儲和處理圖片的電腦耗電量很大。Scheres表示，每天至少要花費近4萬人民幣，對於很多地方來說，這個費用太高。為了推廣低溫電子顯微鏡，很多基金會建立了對外公開的設備，各地研究者們可以預約使用。霍華德·休斯醫學研究所(Howard Hughes Medical Institute, HHMI)在珍利亞農場研究園區配備了一臺。這臺設備對所有HHMI資金的研究者公開。在英國，政府和維康信託在牛津大學附近建立了低溫電鏡公開使用平臺。參與該平臺搭建的倫敦大學(University of London)的結構生物學家Helen Saibil表示，有很多人想學習使用低溫電鏡。

　　洛克菲勒大學(Rockefeller University)的生物物理學家Rod MacKinnon就是這些人之一。他在2003年因解析一些離子通道的結晶結構而獲得諾貝爾獎。MacKinnon現在對低溫電鏡非常著迷。「我現在處於學習曲線的斜坡階段，非常熱切。」 MacKinnon這樣說道。他打算用低溫電鏡來研究離子通道是如何開和關的。

　　1997年時，Henderson非常堅定地宣稱，低溫電鏡會成為解析蛋白結構的主流工具。在將近20年後的今天，他的預測比當年有了更多底氣。Henderson表示，如果低溫電鏡保持這樣的勢頭繼續發展，技術問題也得以解決，那麼低溫電鏡不僅會成為解析蛋白結構的第一選擇，而是主流選擇。這個目標已經離我們不遠了。

　　原文檢索：

　　Ewen Callaway. (2015) The revolution will not be crystallized. Nature, 525(7568):172-174.