細胞技術 血細胞的離心分離

       在現代臨床醫學研究中，常常需要將全血中單核白細胞(淋巴細胞、大單核細胞)與紅細胞和多形核白細胞分離。在臨床治療應用中常常需要將全血作成分分離(全血分離成血漿，血小板，白細胞，紅細胞等等)

　　(一)血細胞的實驗室純化：

　　血液中存在著各種不同類型的血細胞，每種類型細胞有不同的特點和功能。醫學研究常常需要較純的單一品種的血細胞。用離心法分離和純化是非常有效的手段，但如何使血細胞的密度梯度分離簡單而且實用，很多科學家和試劑生產廠作了大量的研究和篩選。在這方面Bφyum(文獻1)做了開拓性的研究，他使用挪威Nycomed pharma，A/S公司生產的梯度材料Lymphoprep 和由瑞典Pharmacia-Biosystems AB 公司提供的Ficoll Paque，用簡單的低速階梯梯度離心純化了單核白細胞獲得成功。此後(文獻2)，用非電離性梯度材料Na-metrigoate 和Nycodenz(可消除多糖成分)純化血細胞效果更好。

　　典型的離心分離實驗：

　　1. 人血單核細胞的純化：

　　Ⅰ 加有抗凝劑的全血樣品，通常加0.32%檸檬酸鈉較為普遍;

　　Ⅱ 用等量的等滲鹽液稀釋全血

　　Ⅲ 在10-15ml離心管下部注入3ml Na-metrizoate-Ficoll分離液

　　Ⅳ 在分離液上部小心地鋪蓋6ml已經稀釋的全血

　　Ⅴ 低速離心機，水平轉頭，單管容量10-15ml，600xg，20分鐘，20℃，慢加速，慢減速。(不要用4-5℃，否則效果很差)

　　Ⅵ 離心後，單核細胞和少量血小板懸浮在血液樣品和分離液的中向夾層，小心地用吸管吸出

　　Ⅶ 在單核細胞中加幾毫升生理鹽水以降低其密度

　　Ⅷ 用同樣的離心機250xg，5分鐘，20℃「洗」數次，可以得到更純的單核細胞沉澱

　　Ⅸ 製備的細胞可重懸浮在生理鹽水或同源血漿中待用

　　2. 單核血細胞和多形核血細胞的單次離心分離法：

　　Ⅰ 剛抽出的新鮮人血，加抗凝劑後，取3-5ml鋪在10ml離心管底部

　　Ⅱ 血樣上部鋪等量的Polymorphoprep(Nycomed Pharma A/S公司產品)

　　(注意：選擇較細長透明塑料(PC或PET)離心管或玻璃離心管，液柱總高在6-10mm左右)

　　Ⅲ 離心：低速或高速冷凍離心機水平轉頭450g×35分鐘，20℃

　　Ⅳ 離心後細胞分布：以10cm液柱為例，底部1.2-1.4cm為紅細胞，往上3cm為分離液，再往上0.4cm為中性白細胞帶(多形核白細胞)，再往上0.6-0.8cm為分離液，在這層分離液和最上層血漿之間夾有一層約0.4cm液柱高的單核細胞

　　Ⅴ 如果離心時間過長，或溫度過高，多形核白細胞(主要是中性白細胞)也會變成沉澱

　　常用的商品化的分離介質：

介質商品名稱	成分	分離對象	供應商
Lymphoprep	9.6%(w/v) Na-metrigoate 5.6%(w/v)Ficoll	單核白細胞	Nycomed-pharma
Ficoll-paque	9.6%(w/v) Na-diatrigoate 5.6%(w/v)Ficoll	同上	Pharmacia-Biosysstems
Nycoprep1.077	14.1%(w/v)Nycodenz 0.44%(w/v)Nacl	同上	Nycomed-pharma
Nycoprep mixer	19.0%(w/v)Nycodenz 0.290%(w/v)Nacl	同上	Nycomed-pharma
Nycoprep 1.068	13.0%(w/v)Nycodenz 0.58%(w/v)Nacl	同上	Nycomed-pharma
Nycoprep 1.063	12%(w/v)Nycodenz 0.56%(w/v)Nacl	單核細胞	Nycomed-pharma
Mono-poly resolving medium	15.5%(w/v) Na-diatrizoate 8.18%(w/v)Ficoll	多形核細胞	Flow Laboratories
Polymorphoprep	13.8%(w/v) Na-diatrizoate 8.0%(w/v)Dextran 500	多形核細胞	Nycomed-pharma

　　(二)人全血的成分分離：

　　在血站或血液中心用大容量冷凍離心機和多聯血袋進行大量的血液成分分離

　　以下介紹在我國有500臺以上主機，分布在300多個血站的日立CR-7大容量離心機作血液成分分離的二種主要方法(富含法和白膜法)的離心工藝，僅供參考。

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