普境安消毒劑對降低偽狂犬病毒、禽痘病毒活性效果評估委託單位： 綠臣(上海)國際貿易有限公司\成都傑鑫瑪生物科技有限公司
評價產品： 普境安乾粉消毒劑
四川農業大學動物生物技術中心-Animal Biotechnology Technology Center of Sicau
聲 明
一、對本報告有異議者，請於收到報告之日起 7 日內以書面方式提出，逾期不予受理。
二、本報告所出具的結論和數據，僅對實驗樣品有效。
三、本報告塗改、增刪或未加蓋實驗單位印章的複印件均無效。
四、報告書上的實驗結果和實驗單位名稱，不得用於廣告及商業宣傳。
普境安說明：「普境安」主要成分為磷酸鹽化合物（85%）、鈣、鐵、硫酸鹽（2.6%）、活性氯、Perica 油（0.05%）和鋁矽酸鹽（10.1%）。其不具有或具有較低的殺菌、殺結核菌、殺真菌和殺病毒的作用。但具有很強地降低病毒滴度，可能還可以降低大量細菌。減少微生物吸附造成的對表面微生物汙染的作用，吸附地板上的水和尿素，減少銨排放，稍微的防臭作用使「普境安」適合用作很好的衛生材料。評價目的：評價「普境安」體外降低偽狂犬、禽痘病毒活性效果。
評價方法：將 「普境安」消毒劑設置梯度使用劑量（2/1 推薦劑量、推薦劑量、
2 倍推薦劑量）在不同溫度（4 ℃、16 ℃、37 ℃）、不同時間（5 min、15 min、30 min、45 min）、不同環境和偽狂犬病毒（PRV）、禽痘病毒(FPV)分別作用後測病毒 TCID50，抽提核酸後用螢光定量 PCR 方法檢測病毒核酸含量，觀察「普境安」對偽狂犬毒和禽痘病毒的吸附效果。模擬消毒劑使用的現場環境（土壤、水泥地、糞便）和偽狂犬病毒、禽痘病毒分別混合後再使用「普境安」乾粉消毒劑作用，分別設置 3 個變量（劑量、溫度、時間）檢測不同情況下「普境安」乾粉消毒劑吸附病毒降低病毒活性的作用。
評價時間： 2019 年 5 月-6 月
1、主要試劑及實驗動物
1.1毒株
豬偽狂犬病毒（PRV-XJ）：保存於四川農業大學動物生物技術中心；禽痘病毒毒株：保存於四川農業大學動物生物技術中心。
1.2主要試劑
胎牛血清、細胞培養液（DMEM 培養液）、胰蛋白酶、PBS 緩衝液、PK-15 細胞，雞胚成纖維細胞，螢光 PCR 引物，均由實驗室提供；「普境安」消毒劑由丹麥（Stormllen 公司）、成都傑鑫瑪生物科技有限公司生產提供。
2、消毒劑安全評估結果
2.1偽狂犬病毒和禽痘病毒滴度測定
2.1.1病毒液製備
將 PRV 病毒液和 FPV 病毒液按常規操作分別接種於生長良好的 PK15 細胞和雞胚成纖維細胞細胞，37℃、5%二氧化碳條件下培養，當病毒發生 70%-80% 感染時，將病毒液反覆凍融 2-3 次，收集病毒液離心取上清，分裝於 2 ml EP 管中。
2.1.2測定偽狂犬病毒和禽痘病毒的 TCID50
取上述製備好的病毒懸液用無血清的 DMEM 細胞培養液進行 10 系列的稀釋（10-1～10-10），分別接種於長滿單層 PK-15 細胞和雞胚成纖維細胞細胞的 96孔培養板中，每一稀釋度接種一縱排共 8 孔，每孔接種 100 L 的病毒懸液；用含 2% PBS 的 DMEM 細胞培養液作為對照，置 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養， 觀察細胞有無 CPE 變化並記錄結果。按 Reed-Muench 法計算病毒的 TCID50。
2.1.3偽狂犬病毒和禽痘病毒滴度測定結果
病毒滅活滴度用半數細胞感染劑量（TCID50）表示。計算公式如下：
TCID50 對數值=病變率高於 50%組稀釋度的對數值+距離比例
（「病變率高於 50%組」是指病變率超過 50%的最低組，下面均簡稱「高於 50% 組」；「病變率低於 50%組」是指病變率低於 50%的最高組，下面均簡稱「低於 50%組」）。
根據表和表 2 中結果，按 Reed-Muend 法計算出偽狂犬病毒的 TCID50 值為
10-8.21/0.1 ml ,禽痘病毒的 TCID50 值為 10-6.73/0.025 ml。
2.2普境安消毒劑接觸時間對禽痘病毒和偽狂犬病毒體外殺滅效果測試
取 288 個無菌培養皿，一半培養皿（108 個試驗組+36 個對照組）塗 1 ml 禽痘病毒液，另一半培養皿（108 個試驗組+36 個對照組）塗 1 ml 偽狂犬病毒液後放於 37 ℃無菌恆溫箱乾燥。向已乾燥的病毒培養皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 劑量加入粉劑「普境安」，在 4 ℃、16 ℃、37 ℃條件下使消毒劑單獨與等份的病毒保持接觸 5 min，15 min，30 min，45 min（試驗組每組設置三組重複， 最後取平均值，不同溫度下不同時間設置空白對照組無消毒劑作用也做三組重複）。後將「普境安」乾粉移除，用 1ml DMEM 細胞培養液重懸收集培養皿中的病毒，做梯度稀釋後測定試驗組與對照組的 TCID50 對比病毒滴度的差異。
試驗結果表明（表 3），普境安粉狀消毒劑受溫度的影響較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸 15 分鐘後滴度減少平均達
到 4 以上，在作用 30 分鐘後滴度減少平均達到 5 以上，但在推薦劑量時殺滅效果最佳。
2.3螢光定量檢測普境安對禽痘病毒和偽狂犬病毒體吸附效果
取 288 個無菌培養皿，一半培養皿（108 個試驗組+36 個對照組）塗 1 ml 禽痘病毒液，另一半培養皿（108 個試驗組+36 個對照組）塗 1 ml 偽狂犬病毒液後放於 37 ℃無菌恆溫箱乾燥。向已乾燥的病毒培養皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 劑量加入粉劑「普境安」，在 4 ℃、16 ℃、37 ℃條件下使消毒劑單獨與等份的病毒保持接觸 5 min，15 min，30 min，45 min（試驗組每組設置三組重複， 最後取平均值，不同溫度下不同時間設置空白對照組無消毒劑作用也做三組重複）。後將「普境安」乾粉移除，用 1ml DMEM 細胞培養液重新懸浮收集培養皿中的乾燥病毒，抽提病毒 DNA，檢測 DNA 濃度。梯度稀釋的標準品（即病毒原液）及待測樣品進行實時定量 PCR ，用標準品製作標準曲線，檢測對照組和
試驗組病毒核酸含量，對比差異。
試驗結果表明（表 4），普境安粉狀消毒劑可在不同溫度和濃度下均可有效吸附環境中的病毒，在移除普境安粉末的同時能移除大量病毒，其受溫度影響較小，推薦劑量在接觸 15min 以上能大幅降低病毒量達到較好的清除效果。
2.4普境安消毒劑在土壤環境中對病毒的吸附效果
試驗設置 A、B 組，每組三個重複，A 為偽狂犬病毒組：5×5×5 cm3 的土壤中加 2 ml PRV 病毒原液；B 為禽痘病毒組：5×5×5 cm3 的土壤中加 2 ml FPV 病毒原液，同樣在不同溫度不同時間下設置空白對照組無消毒劑作用也做三組重複。每組分別設置 4 ℃、16 ℃、37 ℃三個溫度梯度，每個溫度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 的量加入粉劑「普境安」，作用 5 min、15 min、30 min、45 min
後用生理鹽水將土壤溶解，4000 r/min 離心 5min 取上清，然後將上清做梯度稀釋檢測病毒滴度，對比消毒劑處理前後病毒滴度的差異。
試驗結果表明（表 5），在土壤環境中，普境安粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸 5 分鐘後大幅度降低病毒滴度，在接觸 15 min 後病毒滴度平均降低 4 以上。
2.5普境安消毒劑對糞便環境中病毒的吸附效果
試驗設置 A、B 組，每組三個重複，A 為偽狂犬病毒組：5x5x5 cm3 糞便加 2 ml PRV 病毒原液；B 為禽痘病毒組：5x5x5 cm3 糞便加 2 ml FPV 病毒原液，同樣在不同溫度不同時間下設置空白對照組無消毒劑作用也做三組重複。每組分別設置 4 ℃、16 ℃、37 ℃三個溫度梯度，每個溫度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉劑「普境安」，作用 5 min、15 min、30 min、45 min 後用生理鹽水將土壤溶解，4000 r/min 離心 5min 取上清，然後將上清做梯度稀釋檢測病毒滴度， 對比消毒劑處理前後病毒滴度的差異。
試驗結果表明（表 6），在糞便環境中，普境安粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸 15min 後病毒滴度平均降低 4 以上。
2.7 普境安消毒劑對水泥地面環境中病毒的吸附效果
試驗設置 A、B 組，每組三個重複，A 為偽狂犬病毒組：100 cm2 的水泥地面上加 2 ml PRV 病毒原液；B 為禽痘病毒組：：100 cm2 的水泥地面加 2 ml FPV病毒原液，同樣在不同溫度不同時間下設置空白對照組無消毒劑作用也做三組重複。待病毒液幹後，每組分別設置 4 ℃、16 ℃、37 ℃三個溫度梯度，每個溫度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 的量加入粉劑「普境安」，作用 5 min、15 min、 30 min、45 min 後移除「普境安」，用生理鹽水衝洗地面後將其收集。然後做梯度稀釋檢測病毒滴度，對比消毒劑處理前後病毒滴度的差異。
試驗結果表明（表 7），在糞便環境中，普境安粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸 15min 後病毒滴度平均降低 4 以上。
3、評價情況總結
結果顯示：「普境安」消毒劑對偽狂犬病毒和禽痘病毒有很好的滅活作用，不同溫度對其滅活作用影響不大，建議使用推薦劑量。模擬消毒劑使用的現場環境試驗中「普境安」對兩種病毒都有很好的滅活效果，可以為其使用提供參考依據。
綜合評定認為：「普境安」消毒劑對環境中病毒有很好的滅活作用，可以用於生產消毒。
四川農業大學動物醫學院動物生物技術中心
2019 年 7 月