背景介紹
染色體拷貝數變異(Copy Number Variations, CNVs)，是人類癌症的一個常見特徵。越來越多的證據表明，一些 CNVs 可能發生在腫瘤發生的早期階段，這表明某些腫瘤相關 CNVs 可能是腫瘤發生的驅動因素。
有研究表明，抑癌基因在染色體缺失區域富集，而原癌基因則在染色體擴增中富集。鑑於每個 CNV 都涉及大量基因，因此，從功能上識別潛在的抑癌基因和原癌基因，能夠更好地了解 CNVs 在癌症發生中的機制。
在所有 CNVs 中，雜合性染色體 17p 缺失(del(17p))是實體腫瘤和造血系統惡性腫瘤 (包括淋巴瘤和白血病) 中最常見的染色體丟失。長期以來，人們一直認為 del (17p) 的唯一作用是導致TP53 雜合性缺失。
然而，17p 區域是否存在其他抑癌基因以及其潛在的功能又是什麼？
2020 年 9 月 25 日，來自四川大學華西醫院的劉玉、陳崇團隊合作在國際著名期刊CANCER DISCOVERY（IF=29.5）在線發表題為 An epigenetic mechanism underlying chromosome 17p deletion-driven tumorigenesis 的研究性論文，該研究利用多種功能遺傳策略，鑑定出一個新的 17p 腫瘤抑制基因 —— PHD finger protein 23(PHF23)，研究發現，PHF23 的丟失會損害 B 細胞分化並促進未成熟的 B 淋巴細胞惡性腫瘤的發生。機制層面上，他們發現 PHF23 可通過 N - 末端直接與 SIN3-HDAC 複合物結合，並抑制其在 H3K27ac 上的去乙醯化活性。
圖片來源：CANCER DISCOVERY
研究內容
PHF23 為單倍劑量不足的抑癌基因
首先，研究人員通過無偏頗的體內腫瘤發生因素的篩選中發現多個靶向 PHF23 的 shRNA 在淋巴瘤 / 白血病中富集。通過進一步分析 TCGA 資料庫中彌散大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL) 的樣本信息，他們發現，del(17p) 組的 PHF23 表達顯著降低，這與 DNA 拷貝數丟失的情況一致。因此，研究人員推測 PHF23 可能是 17p 染色體上的一個新的抑癌基因。
為了驗證 PHF23 在 B 細胞惡性腫瘤中的作用，他們利用多個獨立的 PHF23 shRNAs 和對照腎細胞 shRNA (shRen) 與 GFP 和 Myc 共導入 C57BL/6 小鼠骨髓分離的 pre-B 細胞中。然後將 shPhf23 或 shRen 細胞移植到亞致死照射的同種受體小鼠中。結果發現，shPhf23 的生存周期顯著縮短、淋巴結顯著增大，並且其腫瘤細胞幾乎均為 GFP 陽性細胞。
染色體 17p 缺失通常以雜合缺失的形式出現。然而，帶有 del (17p) 的 PHF23 突變在人類癌症中較為罕見，不過，del (17p) DLBCL 患者的 PHF23 表達較 17p 染色體完整的患者明顯降低。因此，研究人員推測 PHF23 也可能是 17p 染色體上的單倍劑量不足的抑癌基因。
為了驗證這一假設，他們通過 CRISPR/Cas9 技術編輯生成 Phf23 敲除小鼠。將 Phf23 野生型、雜合子和純合子敲除的胎肝細胞經 Myc cDNA 轉導，然後移植到亞致死輻照的同種受體小鼠中。結果與上述發現一致，與接受野生型胎肝細胞的小鼠相比，Phf23 雜合子和純合子敲除組的腫瘤發病時間明顯縮短，並且其生存周期也顯著縮短，這些結果表明 PHF23 為單倍劑量不足的抑癌基因。
PHF23通過結合H3K4me3、H3K27ac發揮作用
有報導表明 PHF23 在其 C - 末端含有一個 PHD 結構域，該結構域被證明與 H3K4me3 特異結合，而 H3K4me3 通常富集於活性啟動子上。研究人員通過染色質免疫沉澱測序 (ChIP-seq) 研究了野生型 PHF23 在小鼠 pro/pre-B 細胞系 (29)Ba/F3 細胞中的功能，發現超過 90% Phf23 結合峰與 H3K4me3 峰重疊。同時，與 shRen 細胞相比，Phf23 敲除的 pre-B 細胞下調的基因比上調的基因更明顯 (153 vs. 14)。這些結果均表明，PHF23 與 H3K4me3 共定位並協同調控基因的激活。
為探索PHF23 是如何調控基因表達的，研究人員進行了免疫共沉澱質譜 (Co-IP/MS) 分析，以確定潛在的 PHF23 結合靶點。結果發現，富集度最高的是 SIN3 轉錄調節家族成員 a 和 b (SIN3A 和 SIN3B)，SIN3 是 SIN3- HDAC 複合物中的主支架蛋白，它可以抑制轉錄，並參與各種生物和細胞過程。
SIN3-HDAC(組蛋白去乙醯化酶) 複合物包含多個緊密相關的成分，在 Co-IP/MS 檢測分析中，所有這些緊密相關的成分都與 PHF23 發生了免疫共沉澱，包括該複合物的核心催化蛋白 HDAC1 和 HDAC2，後續的驗證實驗也證實了上述分析結果。
這些結果表明PHF23 直接與 SIN3-HDAC 絡合物相互作用，形成 PHF23-SIN3-HDAC (PSH) 複合物，以發揮基因調控的作用。
PSH複合物在腫瘤發生過程中發揮重要作用
PHF23 包含多個功能域，那 PHF23 與 SIN3-HDAC 是通過什麼進行結合的呢？
研究人員利用 PHF23 截斷的突變體檢測了 PHF23 的哪個區域與 SIN3-HDAC 複合物相互作用。結果發現捲曲線圈和 PHD 結構域的截斷 (CC 和PHD) 都沒有影響 PHF23 與 SIN3A 和 HDAC1 的結合。然而，N 端截斷 (N) 完全中斷了 PHF23 與 SIN3A-HDAC1 的相互作用，表明PHF23 是通過其 N 段與 SIN3-HDAC 複合物進行結合的。
考慮到 PSH 在組蛋白修飾和基因調控中的重要性，研究人員進一步探索了該複合物是否在淋巴瘤 / 白血病的發生和維持中發揮重要作用。結果發現，敲除 Sin3a 完全阻斷了 Phf23+/- 誘導的淋巴瘤 / 白血病的發生，同樣，Sin3b 缺失也顯著延長了 Phf23+/- 移植小鼠的無瘤生存。
上述結果表明 PSH 複合物對腫瘤的發生至關重要，那麼其在腫瘤維持中又發揮怎樣的作用呢？
研究人員通過 shRNA 降低了 Sin3a 在 shPhf23 淋巴瘤 / 白血病細胞和 Ba/F3 細胞中的表達，結果顯示，Sin3a 敲低特異性地損害了 Phf23 缺失組淋巴瘤 / 白血病細胞的生長，但對 Ba/F3 細胞影響輕微，Sin3b 的敲低亦得到相似的結果。此外，與 shRen 相比，Hdac1 shRNAs 顯著降低了 Phf23 缺失組淋巴瘤 / 白血病的存活。另外，HDAC 抑制劑 Entinostat、Mocetinostat 和 Chidamide可特異性誘導 shPhf23 組淋巴瘤 / 白血病細胞死亡，但在給定濃度下不能誘導對照 Ba/F3 細胞死亡，這表明這些小分子對 Phf23 缺陷腫瘤的潛在治療劑量。
最後，考慮到 PHF23 的 N 端是介導 PSH 複合物形成的關鍵區域，他們將全長或其他 PHF23 突變體引入 PHF23 缺陷腫瘤細胞中。結果表明，全長 PHF23 特異性抑制 PHF23+/- 淋巴瘤 / 白血病，而對 Ba/F3 細胞無顯著作用，進一步證實了 PHF23 是一種真正的抑癌基因，而 N 端缺失 PHF23 則完全喪失了其抑瘤功能，這強烈暗示了 PHF23 N 端介導的 PSH 複合物是維持腫瘤的必要條件。
研究總結
該研究首先確定 PHF23 是一個 17p 的抑癌基因，它的丟失對腫瘤的發生和腫瘤的維持都是至關重要的。PHF23 與活性組蛋白標記物 H3K4me3 共定位，通過 N 端直接結合 SIN3-HDAC 並形成 PSH 複合物，PSH 複合物為 H3K4me3 和 H3K27ac 之間的基因激活提供了協同作用，尤其是抑癌基因和分化基因。
總之，這項研究揭示了腫瘤發生中一種新的表觀遺傳調控機制，它有助於 17p 缺失腫瘤的內在機制研究，並提示了這類疾病新的易感性。
(TSG, tumor suppressor gene)
劉玉教授、陳崇教授為該研究的共同通訊作者。不僅如此，2016 年，兩人並列共同第一作者在Nature發表題為 Deletions linked to TP53 loss drive cancer through p53-independent mechanisms 的研究性論文，表明17p 缺失帶來的表型超出了僅通過 TP53 缺失展現出的表型；同時還證明染色體片段缺失事件可能是由於破壞多個基因的選擇性優勢而產生的，並提供了一個解剖那些常見、但尚未得到充分研究的促癌病變機制的新的視角。
圖片來源：Nature
參考文獻
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題圖來源：站酷海洛 Plus
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