...菌和酶製劑對白羽肉雞生長性能、腸道健康及腸道微生物組成的影響

為了保證肉雞的健康快速生長，生產中常大量使用具有促生長作用的抗生素。然而，抗生素的大量使用同時帶來細菌耐藥性增加等負面效應，因此越來越多的國家開始限制抗生素的使用[1-2]。在禽類生長中，抗生素主要作用是提高禽類生長性能並保護腸道健康從而抑制腹瀉等疾病發生[3]。因此，如何選擇和應用具有以上功能的抗生素的替代品成為肉禽養殖業亟須解決的問題之一。

丁酸鈉具有提高肉雞生長性能和促進腸道健康的作用。它主要通過改善腸道微生物組成、緩解炎症、提高免疫力以及促進腸道屏障功能等途徑發揮上述作用[4-9]。

益生菌如丁酸梭菌等同樣由於可改善腸道微生物組成，可以作為抗生素的替代品對肉雞生長性能發揮積極作用[10-12]。此外，已有研究報導，益生菌與酶製劑（木聚糖酶、葡聚糖酶、澱粉酶和蛋白酶等）具有協同作用，可以提高肉雞飼料利用率、腸道健康和生長性能[13]。但是，目前關於早期丁酸鈉營養幹預及其與益生菌、酶製劑聯合應用對肉雞生長性能、腸道健康和腸道微生物組成的研究較少。因此，本試驗研究了早期添加丁酸鈉以及早期添加丁酸鈉，且全程添加益生菌和酶製劑對白羽肉雞生長性能、腸道形態結構、腸道氧化應激反應、炎性因子和緊密連接蛋白基因表達以及腸道微生物組成的影響，以期為丁酸鈉、益生菌和酶製劑在肉雞生產中的聯合應用提供參考。

1 材料和方法1.1 材料與試驗設計試驗方案經中國科學院亞熱帶農業生態研究所（中國長沙）動物試驗方案管理與評審委員會批准，按照動物保健和福利的指導對肉雞進行照料和屠宰。試驗從肉雞孵化場購買剛出雛的AA白羽肉仔雞2 100隻，隨機分配到3個處理組：對照組飼餵基礎日糧；丁酸鈉組，第1~14 d在基礎日糧中添加0.1%的丁酸鈉，然後飼餵基礎日糧；複合組，第1~14 d在基礎日糧中添加0.1%的丁酸鈉，全程在基礎日糧中添加0.02%益生菌和0.05%酶製劑。每個處理10個重複，每個重複70隻肉雞。整個飼養期為42 d。試驗各階段基礎飼糧在參照NY/T 33—2004的基礎上，結合生產實踐配製，其基礎日糧組成營養水平見表1。進雞時，前3 d圈舍溫度保持33 ℃，隨後逐漸降低，在21 d時，溫度保持23 ℃，此後保持該溫度到試驗結束。全期自由採食和飲水。丁酸鈉、益生菌和酶製劑（羅酶寶，優越型複合酶AP10）均由安迪蘇生命科學製品（上海）有限公司提供。益生菌主要成分為枯草芽孢桿菌製劑，有效含量2.0×109 CFU/g；酶製劑主要成分為木聚糖酶和β-葡聚糖酶，酶活單位分別是木聚糖酶大於等於2 200黏度單位/g，β-葡聚糖酶大於等於200 AGL單位/g。

1.2 生長性能與死亡率分別於0、21、42日齡以重複（欄）為單位稱重，計算生長前期（1~21日齡）、後期（22~42日齡）和全期（1~42日齡）各重複的平均日增重。記錄試驗全程採食量和死亡雞隻數，以重複為單位計算階段平均日採食量、料肉比和死亡率。

平均日採食量=總採食量/（天數×只數）料肉比=平均日採食量/平均日增重死亡率=死亡數/總只數1.3 樣品採集試驗第42 d肉雞稱重後，每個重複選取3隻體重適中的肉雞並屠宰，分離迴腸（近盲腸）取2 cm左右固定於10%的福馬林溶液，用於觀察腸道組織形態。收集迴腸樣品液氮速凍後，保存於-80 ℃，用於測定腸道氧化還原狀態指標和相關基因表達。分離盲腸，收集盲腸食糜測定腸道菌群。每欄中的3個樣品混合成一個樣品作為一個重複。

1.4 測定指標與方法1.4.1 腸道形態結構分析取10 %的福馬林溶液中固定好的迴腸樣品包埋於石蠟塊中，然後將石蠟塊中組織切成8 μm厚附著於載玻片上，用伊紅蘇木素染色觀察腸道形態結構。

1.4.2 腸道氧化應激狀態指標測定製 備 回 腸 的 組 織 勻 漿， 測 定 總 超 氧 化 物 歧 化 酶（T-SOD）、總抗氧化酶（T-AOC）和穀胱甘肽還原酶（GR）的酶活以及丙二醛（MDA）與穀胱甘肽（GSH）含量。測定採用南京建成生物功能研究所提供的試劑盒，按照說明書上的操作步驟進行測定。

1.4.3 螢光定量分析從迴腸樣品中提取RNA，通過應用反轉錄試劑盒（Takara，北京，中國）進行轉錄獲得cDNA，採用實時螢光定量PCR分析相關基因表達量（引物的序列見表2）。

1.4.4 腸道微生物組成分析盲腸內容物用QIAamp DNA stool Mini天根生化科技（北京）有限公司提取DNA樣本。應用16S rDNA擴增子測序技術進行PCR擴增，對擴增產物進行純化獲得400~450 bp長度的產物 ；委託北京百邁客生物科技有限公司進行文庫製備、庫檢、上機測序以及結果分析等。

1.5 數據統計與分析採 用SPSS 22.0進 行 單 因 素 方 差 分 析（One way ANOVA），用Duncan氏法進行多重比較，以P

2 結果與分析2.1 丁酸鈉、益生菌和酶製劑對白羽肉雞生長性能和死亡率的影響（見表3）由表3可知，與對照組相比，丁酸鈉組和複合組肉雞21 d末 重 顯 著 提 高（P

與對照組相比，1~42日齡期間丁酸鈉組和複合組肉雞的平均日增重和日採食量均顯著提高（P

2.2 丁酸鈉、益生菌和酶製劑對白羽肉雞腸道形態結構的影響（見表4）由表4可知，與對照組相比，丁酸鈉和複合組絨毛高度顯著增加（P0.05）；與對照組相比，複合組絨毛高度與隱窩深度的比值顯著升高（P0.05）。

2.3 丁酸鈉、益生菌和酶製劑對白羽肉雞腸道氧化應激狀態的影響（見表5）由表5可知，與對照組相比，複合組肉雞腸道T-AOC和GR活 性， 以 及GSH濃 度 顯 著 升 高（P0.05）；與對照組相比，丁酸鈉組和複合組肉雞腸道T-SOD活性顯著升高（P

2.4 丁酸鈉、益生菌和酶製劑對白羽肉雞腸道炎性因子和緊密連接蛋白基因表達的影響（見表6）由表6可知，與對照組相比，丁酸鈉組和複合組肉雞迴腸occludin, claudin-1和ZO-1 mRNA表達量顯著增加（P

2.5 丁酸鈉、益生菌和酶製劑對白羽肉雞腸道微生物組成的影響（見表7）由表7可知，微生物組成分析發現丁酸鈉組和複合組肉雞微生物豐富度顯著高於對照組（P

3 討論研究表明，丁酸或者其鈉鹽丁酸鈉可以顯著提高肉雞生長性能[14-15]。也有研究認為，丁酸鈉對正常飼養管理下的肉雞生長性能無顯著影響[4,16-17]。本試驗結果發現，僅在1~14日齡白羽肉雞飼料中添加0.1%的丁酸鈉即可顯著提高肉雞的生長性能。Leeson等[16]和Smulikowaka等[18]認為，丁酸鈉的添加量以及肉雞所處環境可能是導致上述研究不一致結果的主要原因。因為他們發現，當肉雞處於高度潔淨、病原菌少的環境中時，飼料中添加丁酸鈉對肉雞生長性能無顯著影響。此外，本研究發現，在前期（1~21 d）飼糧中同時添加益生菌和酶製劑時，肉雞生長性能不再顯著提高。在後期（22~42 d）飼糧中繼續添加益生菌和酶製劑後，肉雞生長性能雖然與單獨添加丁酸鈉組無顯著差異，但有提高的趨勢（0.05

由於本試驗過程中肉雞日糧中未添加任何抗生素或其他促生長以及抗菌類添加劑，因此對照組和試驗組肉雞生長性能遠低於實踐生產中的生長性能。此外，本試驗肉雞並未處於高度潔淨的生長環境，添加丁酸鈉顯著提高了肉雞生長性能。

腸上皮的長絨毛和淺隱窩說明腸上皮細胞與營養物質的接觸表面積大，這種情況有利於提高腸上皮細胞吸收能力及促進腸道健康發育[19-21]。本試驗研究發現，飼糧中添加丁酸鈉雖然對白羽肉雞迴腸隱窩深度無顯著影響，但可以顯著提高迴腸絨毛高度。這一結果與之前關於丁酸鈉的研究相一致[17]。丁酸鈉的這一作用可能是由於其活性成分丁酸可以快速被腸上皮細胞吸收，從而作為能量物質促進腸道細胞發育和提高腸上皮吸收功能等[22]。通過對腸上皮細胞形態學觀察發現，飼糧中添加丁酸鈉可以減少腸絨毛脫落，維持腸絨毛的完整性。此外，本試驗通過檢測基因表達還發現丁酸鈉同時還促進了腸道緊密連接蛋白的表達。添加丁酸鈉的同時添加益生菌和酶製劑同樣可以顯著提高絨毛高度和腸上皮緊密連接蛋白的表達，但是與單獨添加丁酸鈉的白羽肉雞無顯著差異（0.05

氧化應激情況下機體促氧化系統和抗氧化系統失衡，從而可能導致營養物質的浪費，且在氧化應激過程中產生的過量自由基可能對機體造成損失[23]。炎症反應通常也伴隨著氧化應激發生。本試驗結果發現，添加丁酸鈉可以顯著降低腸道MDA含量，提高SOD活性以及降低IL-1β表達。這些結果進一步證明了丁酸鈉的抗炎抗氧化作用[7,17]。而本試驗結果還表明，聯合添加益生菌和酶製劑可以發揮比單獨添加丁酸鈉更顯著的作用。這說明聯合添加丁酸鈉、益生菌和酶製劑在緩解應激和炎症反應方面具有協同作用。

大量研究表明，腸道微生物是機體維持生理機能和健康的重要決定因素，且腸道微生物尤其對腸道生理功能發揮重要調節作用[24-25]。研究表明，丁酸鈉、益生菌和酶製劑主要通過調節腸道微生物來發揮其作用[10,17, 26]。

本試驗結果表明，早期添加丁酸鈉可以顯著提高盲腸微生物的豐富度，這與Wu等[17]研究結果一致。但也有研究報導丁酸鈉對腸道微生物的alpha多樣性無顯著影響[5,27]。

這種不一致的結果可能是肉雞所處生長環境，以及丁酸鈉的形式，添加濃度和時間等不同而造成的。然而，大部分研究結果都證明丁酸鈉影響腸道微生物的beta指數[5,17,27]。

本試驗結果也提示添加丁酸鈉組微生物組成分布與未添加組是分開的。此外，聯合添加益生菌和酶製劑組微生物組成分布與對照組以及單獨添加丁酸鈉組也是分開的。

各試驗組微生物門水平組成無顯著變化，本試驗的這一結果與之前一些研究不一致[17]。這可能是因為本試驗添加丁酸鈉時間比較短。此外，聯合添加益生菌和酶製劑對微生物門水平組成也無顯著影響，說明益生菌和酶製劑可能不在丁酸鈉的作用基礎上進一步影響微生物。

4 結論在本試驗條件下，飼糧中添加丁酸鈉或者聯合添加丁酸鈉、益生菌和酶製劑可以顯著提高白羽肉雞生長性能，降低死亡率，維持腸道形態結構和完整性，緩解炎症和氧化應激以及影響腸道微生物組成。聯合添加丁酸鈉、益生菌和酶製劑對提高肉雞生長性能和抗炎抗氧化功能具有一定的協同作用。