深度挖掘通過腦腸軸對帕金森治療產生影響的腸道菌及其對應基因

導讀

左旋多巴（Levodopa）可用來治療帕金森，本身無藥理活性，需要進入大腦中樞，經芳香胺基酸脫羧酶（AADC）作用轉化成神經遞質多巴胺而發揮藥理作用。胃腸道也是左旋多巴脫羧反應的主要場所，但是在外圍產生的多巴胺不能穿過血腦屏障，且會導致副作用，因此，左旋多巴要與阻斷外圍代謝的藥物（比如AADC抑制劑卡比多巴）共同使用。儘管使用這些藥物，仍有高達56%的左旋多巴不能到達大腦，並且左旋多巴治療帕金森病的療效和副作用在不同的帕金森患者中是極不均衡的，而且這種差異不能完全由個體代謝的差異來解釋。先前的研究證明腸道菌可以代謝左旋多巴，主要途徑包括左旋多巴的初始脫羧反應，轉化為多巴胺，然後通過脫羥基反應將多巴胺轉化為m-酪胺（圖1A）。雖然知道了這些代謝反應發生在腸道微生物中，但具體的菌、基因和酶是未知的，抑制劑比如卡比多巴（carbidopa）對腸道微生物左旋多巴代謝的影響也不清楚。本文闡明腸道微生物對左旋多巴胺和多巴胺代謝的分子基礎，以了解腸道微生物群對帕金森病治療作用。

文獻ID

題目：Discovery and inhibition of an interspecies gut bacterial pathway for Levodopa metabolism

譯文：腸道微生物對左旋多巴的種間代謝及代謝抑制

期刊名：ScienceIF：41.037

年份：2019

通訊作者：Emily P. Balskus, Peter J. Turnbaugh

單位：哈佛大學、加利福尼亞大學

DOI:10.1126/science.aau6323

研究成果

1、人腸道菌Enterococcus faecalis對左旋多巴有脫羧作用

首先鑑定含有編碼候選左旋多巴脫羧酶基因的菌，由於之前有報導：來源於Lactobacillus brevisCGMCC 1.2028菌的PLP(pyridoxal-5-phosphate）依賴的酪氨酸脫羧酶(TyrDC)在體外對左旋多巴具有活性。通過BLASTP在NCBI上搜索人體微生物組項目(HMP)參考基因中與TyrDC同源的序列，主要在Enterococcus中鑑定出來，另外還包括lactobacilli和Proteobacteria（圖1B）。選擇了10株含有TyrDC同源序列的腸道菌，測試它們在無氧條件下對左旋多巴的脫羧能力，發現Enterococcus faecalis的所有菌株都有完全的脫羧能力（圖1C）。所有的E. faecalis具有保守的4基因tyrDC操縱子，這種高保守的序列與所有E. faecalis具有相同的脫羧作用表型是一致的。

通過體外實驗證明TyrDC是E. faecalis對左旋多巴進行脫羧作用的充分必要條件。菌株E. faecalisMMH594的tyrDC基因經過突變被破壞，就不具有左旋多巴脫羧活性，而它的生長狀態與野生型菌沒有差異（圖1D），並且體外實驗發現TyrDC對左旋酪氨酸的作用是左旋多巴的5倍（圖1E）。此外，研究了酪氨酸的存在是否會干擾E. faecalis對左旋多巴的脫羧作用，發現在純化的TyrDC酶和無氧培養的E. faecalis作用下，左旋多巴和酪氨酸的脫羧作用是同時發生的（圖1F）。

圖1E. faecalis利用依賴PLP的酪氨酸脫羧酶代謝左旋多巴

2、Eggerthella lenta菌利用鉬依賴的酶對多巴胺脫羥

E. Faecalis沒有進一步地代謝多巴胺，本研究用富集培養法分離具有多巴胺脫羥作用的菌，最後發現了一株Eggerthella lentaA2菌具有多巴胺脫羥能力。為了鑑定多巴胺脫羥酶，在E. lentaA2基因組中搜索與4-羥基苯甲醯丙烯酸輔酶A還原酶（4-hydroxybenzoyl-CoA reductase）的同源序列，沒有收穫。然後對E. lentaA2的RNA進行測序，發現三種共存基因在多巴胺應答中表達上調了2500倍，這些基因預測編碼包含雙鉬嘌呤二核苷酸輔因子的酶，該酶屬於二甲基亞碸還原酶家族，猜測該酶是多巴胺脫羥酶（Dadh）（圖2A）。

驗證Dadh是否是鉬依賴的，在E. lentaA2培養基中加入鎢酸鹽，多巴胺的脫羥反應被抑制（圖2B）。然後驗證Dadh在體外的活性（圖2C），脫羥基活性與115-kDa條帶相關，經質譜證實為Dadh。

然後探究dadh基因在基因組中的存在是否與多巴胺脫羥反應相關。BLASTP表明這個酶只在E. lenta或其相近的放線菌中，因此篩選了26個腸道放線菌，看它們在無氧條件下對多巴胺的脫羥作用，發現儘管26株菌中24株含有dadh基因，只有10株Eggerthella菌具有比較好的脫羥作用，這差異與系統進化樹無關（圖2D），菌株水平的差異說明對腸道菌只鑑定到種水平是不能很好地對代謝功能進行預測的。為了探究具體的原因，對具有脫羥作用的E. lenta28B菌和沒有脫羥作用的E. lentaDSM2243菌在存在或不存在多巴胺的狀態下進行RNA測序，發現在兩個菌中dadh對多巴胺應答都出現了上調，表明不是轉錄水平引起的E. lentaDSM2243菌脫羥作用缺失。通過比較蛋白序列，發現506位上有脫羥作用的是精氨酸，沒有脫羥作用的是絲氨酸，只有沒有脫羥作用的E. lentaW1BHI6菌是個例外（Arg506,Cys500）。

圖2Eggerthella lenta菌利用鉬依賴的酶對多巴胺脫羥

3、E. faecalis和E. lenta代謝人腸道中的左旋多巴

將野生型的E. faecalis和E. lentaA2（Arg506）共培養，發現它們能將左旋多巴完全轉化為m-酪胺；tyrDC突變的E. faecalis雖然不能轉化左旋多巴，但是加入額外的多巴胺後，E. lentaA2仍然能轉化多巴胺生成m-酪胺；將野生型的E. faecalis和E. lentaDSM2243 (Ser506)共培養只能生成多巴胺（圖3A）。

探究含氘的左旋多巴在體外糞便懸浮液在E. faecalis和E. lenta作用下的代謝情況，發現19個樣本中有7個沒有檢測到左旋多巴的消耗，而其他的樣本代謝程度也各異（圖3B）。因此考慮tyrDC的豐度是否對代謝能力有影響，通過對tyrDC和E. faecalis進行qPCR，發現有代謝的樣本tyrDC和E. faecalis均高於沒有代謝的樣本（圖3C、D），而E. lenta和dadh的豐度與左旋多巴代謝沒有相關性（圖3E、F）。此外發現了tyrDC和E. faecalis豐度的強烈相關性，揭示了tyrDC基因在E. faecalis中高度保守。這些數據同時說明E. faecalis菌在人腸道左旋多巴代謝中的重要地位。

為了證明E. faecalis在複雜的人腸道中對左旋多巴有脫羧作用，將野生型該菌添加到沒有代謝的樣本中，左旋多巴發生了消耗；將野生型E. faecalis和E. lentaA2添加到沒有代謝的樣本中，生成了m-酪胺。

鑑定dadh基因的SNP，發現含有Arg506的樣本可以代謝多巴胺，而含有Ser506的樣本和不能代謝多巴胺的E. lentaDSM2243菌一致（圖3G）。

圖3E. faecalis和E. lenta預測左旋多巴在複雜人腸道中的代謝

4、(S)-α-Fluoromethyltyrosine (AFMT)抑制腸道微生物對左旋多巴的代謝

卡比多巴（carbidopa）一般作為抑制劑阻斷左旋多巴的外圍代謝（圖4A），本研究發現卡比多巴對TyrDC的阻斷作用200倍低於對AADC的阻斷作用（圖4B、C），且卡比多巴沒有影響E. faecalis和E. lenta的生長和代謝，這些抑制劑對帕金森患者腸道中的左旋多巴脫羧反應沒有起到很好的抑制。2mM的卡比多巴沒有改變左旋多巴脫羧的動力學（圖4D）。

經調研AFMT或許可以作為左旋多巴脫羧的抑制劑（圖4A），體外實驗AFMF很好地抑制了TyrDC催化的左旋多巴脫羧反應，而對AADC沒有很好地抑制（圖4E）。AFMF在E. faecalis培養基中也有效（圖4C）。最後，AFMT完全抑制帕金森氏症患者和神經健康對照組腸道菌群樣本中的左旋多巴脫羧作用（圖4G）。

為了調研AFMT在體內的作用，將AFMT（25mg/kg）和空白對照聯合左旋多巴（10mg/kg）和卡比多巴（30mg/kg）處理E. faecalisMMH594定植的小鼠（圖4H），發現AFMT顯著增加了小鼠血清中左旋多巴的濃度（圖4I）。這些數據表明AFMT可能是研究細菌左旋多巴代謝的一個有前途的工具。

圖4E.faecalis對左旋多巴脫羧作用受AFMT抑制而不是卡比多巴

研究結論

1、發現人腸道中對左旋多巴有代謝作用的菌Enterococcus faecalis和Eggerthella lenta，及其相應基因；

2、發現左旋多巴代謝抑制劑(S)-α-Fluoromethyltyrosine，可抑制腸道微生物對左旋多巴的代謝。

亮點

1、利用資料庫檢索工具，結合轉錄組測序手段，組合完善的實驗驗證過程，探究對左旋多巴代謝相關的腸道菌、基因、酶。

2、對腸道菌群進行轉錄組測序，分析對多巴胺響應的基因，發現有基因上調了2500倍，初步認為它編碼多巴胺脫羥酶，後續對其進行實驗驗證，證明該酶的脫羥作用。

3、對含有dadh基因的不同菌進行轉錄組測序，分析了dadh基因在不同菌中的轉錄水平以及SNP，發現轉錄水平沒有影響脫羥作用的活性，而該基因的序列差異（SNP）影響了脫羥能力。

供稿：劉婷

編輯：魯淑妮

掃一掃，關注本公眾號！

腸菌與健康 microbiota & health

帶你了解腸道菌群與健康的奧秘！