分子植物卓越中心等通過測定非法重組頻率挖掘優質蛋白玉米修飾基因

2020-12-08 光明網

分子植物卓越中心等通過測定非法重組頻率挖掘優質蛋白玉米修飾基因

  12月10日,中國科學院分子植物科學卓越創新中心/植物生理生態研究所巫永睿研究組團隊在Communications Biology 雜誌上在線發表題為High frequency DNA rearrangement at qγ27 creates a novel allele for Quality Protein Maize breeding 的研究文章。優質蛋白玉米胚乳修飾因子qγ27位點結構高度不穩定,該團隊通過巧妙遺傳設計深入解析了該位點發生非法重組的頻率及基因重排的分子遺傳機制。

  基因拷貝數變異(Copy Number Variation, CNV)是驅動物種基因組動態變化的主要動力之一。CNV可由基因複製、缺失及插入引起,它可直接導致基因表達的劑量差異,引起種內個體間表型不同程度的變異,或者新拷貝發生新的變異,從而演化出不同於原始拷貝的表達模式,甚至進化出新的功能。人類基因組有3000 Mbp,4.8-9.5%是由CNV貢獻的,在群體多態性形成中扮演重要作用。玉米基因組有2200 Mbp,大量基因存在基因複製,而CNV是影響不同自交系間表型差異的主要來源之一。CNV主要通過基因同源重組發生。在減數分裂時,如果同源染色體上的不同基因拷貝發生完全等位配對,任何染色體交換(crossover)都不會引起CNV;如果不同基因拷貝之間發生了非等位配對,這個區間的染色體交換就會導致基因重排:一條染色體失去一個或多個拷貝,另外一條得到相應數量的拷貝,這稱之為非法重組。正常的同源重組頻率很容易通過發生交換兩側的標記算出,然而非法重組的頻率很少有直接通過遺傳學實驗精確測定的報導。

  30年前,美國羅格斯大學Joachim Messing實驗室發現玉米27-kDa γ-醇溶蛋白編碼基因(γ27)在不同玉米自交系間存在拷貝數變異,有些自交系含有兩個拷貝,有些只含有一個。Messing實驗室通過Southern Blot實驗發現含兩個γ27拷貝的等位位點(Standard allele, S)可以通過基因重排變成一個拷貝(Rearranged allele, R),然而由於受到實驗體系的限制,這個位點由非法重組導致的基因重排頻率一直無法測定。玉米主要儲藏蛋白是缺乏必需胺基酸賴氨酸的醇溶蛋白。Opaque2(O2)轉錄因子主要調控含量最高的α-醇溶蛋白,在o2突變體中,α-醇溶蛋白大量下降,富含賴氨酸的其他蛋白互補性上調,因此提高了玉米的營養品質。然而o2突變體是粉質表型,不能直接進行產業化。優質蛋白玉米(Quality Protein Maize, QPM)以o2突變體為高賴氨酸供體,通過聚合多個胚乳修飾因子恢復成硬質而育成。前期研究發現優質蛋白玉米高表達γ27醇溶蛋白是粉質胚乳恢復成硬質所必需,後續研究發現優質蛋白玉米高表達γ27醇溶蛋白是因為含有兩個γ27拷貝的S等位基因,說明這個S等位基因在優質蛋白玉米育種中受到了人工選擇。由於很多大芻草(野生玉米)也含有S等位基因,暗示γ27的基因複製發生在玉米馴化之前,而目前玉米自交系含有的單拷貝基因(R等位基因)是S等位基因發生基因重排產生的(圖1a)。普通玉米自交系含有R或S等位基因對籽粒表型沒有任何影響,雖然優質蛋白玉米胚乳修飾必須依賴S等位基因,但其修飾程度受多個因子調控及環境影響。因此,通過籽粒表型篩選S等位基因的重排子很不可靠。

  巫永睿研究組團隊設計了一系列巧妙的遺傳學實驗測定了S等位基因的重排頻率(圖1)。第一個關鍵設計:他們發現這個基因重複片段包含兩個基因,分別是γ27 和 ARID4。ARID4在基因複製後在其3』端產生了一個1923-bp的缺失。利用這個InDel設計一對PCR引物就可以知道某個材料含有S(PCR產物是兩條帶)或R等位基因(PCR產物僅為一條大帶或小帶);第二個關鍵設計:PCR標記是顯性遺傳的,如果父本或母本只有一方發生基因重排,在自交後代中重排帶型與S帶型重疊,無法判斷上代減數分裂中是否發生了基因重排。論文合作者Nebraska州立大學的David Holding實驗室用γ射線輻射誘變優質蛋白玉米K0326Y,創製了該材料的基因組大片段缺失體庫,其中一個材料的S等位基因位點全部缺失(K0326Y-deletion, K-D)。巫永睿團隊把含有S等位基因位點的不同自交系與K-D材料做正反雜交,那麼S等位基因無論在父本或母本減數分裂時產生的單拷貝,都可在下一代被PCR引物檢測到。通過45000多個PCR樣本檢測,該團隊發現了58個重排子,因此S等位基因從上一代到下一代發生基因重排的頻率是1.27 x 10-3。這個頻率比人類基因組中檢測到的幾個高頻重排位點高了100-1000倍,這與玉米自交系基因組變異巨大是一致的。他們還發現A188自交系(2.67 x 10-3) 和K0326Y優質蛋白玉米(2.22 x 10-3)分別從母本和父本遺傳具有最高重排頻率,而W22自交系的父母本重排頻率在所有材料中都是最低的(0.69 x 10-3和0.83 x 10-3),說明不同自交系或同一自交系的父母本在減數分裂時在S等位基因位點形成的非法重組交換次數是有差異的。玉米很多經典突變事件頻率都是可以通過遺傳學實驗測量的,比如Adh1和C1基因發生自發突變的頻率數量級是10-7,Ac轉座子的轉座頻率數量級是10-7,後者與S等位基因發生重排的頻率相當;第三個關鍵設計:基因重排導致一條染色體失去基因拷貝的同時,另一條染色體會得到相應的拷貝數,但是三個拷貝重複的PCR帶型與兩個拷貝的一致,無法通過上述方法鑑定到。UniformMu轉座子突變體庫是以含S等位基因的W22自交系建立的,每個突變體都是從單粒種子自交擴繁的。如果某些突變體在建庫之初發生了基因重排,那麼三拷貝的等位基因就會被保留在UniformMu群體中。研究人員利用定量PCR方法果然篩選到了三拷貝γ27基因的材料。

  三拷貝等位位點比兩拷貝增加了γ27基因的mRNA轉錄和蛋白質合成。通過透射電鏡觀察胚乳澱粉細胞發現三拷貝材料的蛋白體數目和大小都有顯著增加。當研究人員把特異爭對α-醇溶蛋白基因的RNAi轉基因導入三拷貝γ27材料中時,聚合材料不僅含高賴氨酸品質,而且胚乳表現硬質,說明三拷貝γ27等位基因可以在UniformMu材料背景下修飾α-醇溶蛋白基因沉默導致的粉質表型,暗示其將成為一個優良等位修飾位點用於優質蛋白玉米育種。

  山東農業大學作物生物學國家重點實驗室教授劉紅軍、中科院分子植物卓越中心博士生黃永財和山東農業大學博士生李曉寒為論文共同第一作者。用於該研究的優質蛋白玉米輻射誘變材料由美國內布拉斯加州立大學林肯分校植物科學創新中心教授David R. Holding提供,上海交通大學農業與生物學院王文琴研究組參與了合作。巫永睿為通訊作者。研究工作得到國家自然科學基金、中國科技部和中科院等的資助。

[ 責編:戰釗 ]

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