絕了！必讀乾貨：蛋白組學/修飾蛋白組學樣本準備指南
2020-09-03 鹿明蛋白組代謝組好的開始是成功的一半，好的樣品就是實驗成功的首要條件，那麼樣品的收集以及預處理便是決定實驗成敗的重要起點。鹿明生物總結了多年的樣品前處理經驗，下面給大家簡單介紹一下蛋白質組學各類型樣品都是如何進行收集與預處理的？
動物篇
常規組織
（心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、肌肉等）
PBS洗滌去除殘留血液和汙染物，剔除無關的幹擾組織（血管、脂肪、結締組織等）；
衝洗乾淨，用組織剪或手術刀將組織分離成1cm3 左右的小塊；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
軟骨組織
PBS洗滌去除殘留血液和汙染物；
用手術刀將軟骨切成1cm3 左右的小塊；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
軟體動物（吸蟲等）
PBS洗滌去除來自宿主的汙染；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
動物毛髮等
用適量2%SDS，50mM 磷酸鈉（pH7.8）緩衝液漂洗樣品，去除汙染物，乾燥；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
樣品量要求：
常規動物組織（心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、肌肉等）-定量蛋白組學>200mg；修飾磷酸化蛋白組學>500mg
植物篇
大本植物莖、葉、花等
PBS清洗樣品表面泥土或明顯汙染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
大本植物樹根、樹皮、樹枝等
PBS清洗樣品表面泥土或明顯汙染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
草本植物、藻類、蕨類等
PBS清洗樣品表面泥土或明顯汙染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
細小種子（如穀物等）
PBS清洗樣品表面泥土或明顯汙染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
鮮果肉
切取鮮果肉，去皮切成 1cm3 左右小塊；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
花粉
植物開花期收集花粉，解剖顯微鏡下檢查花粉；
用解剖針去除花葯碎片等雜質，轉入EP 管中，光學顯微鏡下檢查花粉的形態和純度；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
樣品量要求：
常規植物組織（幼嫩的根、葉、花、愈傷組織等）-定量蛋白組學>500mg；修飾磷酸化蛋白組學>2g
微生物篇
細菌（菌體沉澱）
4℃，3000-5000×g離心10 min，收集菌體沉澱，棄上清；
用預冷的PBS小心重懸清洗沉澱3次，每次4 °C，3000-5000×g離心10 min，棄上清；
收集管底沉澱，液氮速凍5min，保存於-80℃。
真菌類（菌菇）
PBS 清洗，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
樣品量要求：
菌體沉澱-定量蛋白組學>200mg；修飾磷酸化蛋白組學>1g
細胞篇
懸浮培養細胞
連同培養基轉移到15 mL 離心管中；
4℃，1000 ×g離心10 min收集細胞（1×107個細胞為宜），棄上清；
用預冷的PBS小心重懸清洗沉澱一次，1 ml PBS重懸細胞後轉移到新的1.5 ml離心管中；
1000 ×g離心10 min收集細胞，棄上清；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
貼壁培養細胞
用移液器吸除培養基；
加入滅菌PBS（若用移液槍加，則靠著培養皿壁加入，以免將細胞衝起），平放輕輕搖動1分鐘洗滌細胞，然後棄PBS；
用乾淨的細胞刮棒將細胞刮於培養皿的一側（動作要快），將細胞儘量全部轉移至離心管中；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
樣品量要求：
懸浮/貼壁細胞-定量蛋白組學>1×107個細胞或體積>50ul細胞沉澱；修飾磷酸化蛋白組學>1×108個細胞或體積>500ul細胞沉澱
體液篇
血漿
使用EDTA抗凝管採集血液；
輕輕地上下顛倒混勻 8-10 次；
4℃，1300-2000×g離心10 min，取上清；
用移液器將血漿轉移到離心管中，加入蛋白酶抑制劑，混勻，瞬時離心；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
血清
使用真空採血管收集血液；
輕輕地上下顛倒混勻5-6 次；
4℃，靜置30-60min，讓全血凝集；
4℃，1500-2000×g離心10min，取上清；
用移液器將上層淡黃色血清轉移到離心管中，加入蛋白酶抑制劑，混勻，瞬時離心；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
唾液
禁食兩小時以上，上午取樣；
1000g-2000g 離心5min，（或使用0.22um 濾膜過濾），取上清；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
腦脊液、關節液等體液
1000g-2000×g 離心5min，使用0.22μm 濾膜過濾，取上清；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
樣品量要求：
血漿/血清-定量蛋白組學>100ul；修飾磷酸化蛋白組學>300ul
其他篇
血清/血漿-外泌體
用超速離心或其他方法提取外泌體，用電鏡觀察外泌體形態（推薦）；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
細胞上清-外泌體
細胞在合適的培養基中培養至70%面積，去掉培養基，PBS洗三次；
換用無血清培養基生長一定時間（如24小時）後收集，4度300g離心10分鐘取出細胞，取上清；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
細胞上清
在收集前改用不完全培養基培養，即用不加血清的培養基進行培養；
待細胞鋪滿80%左右，用移液槍吸取上清；
4℃，6000rpm離心5min，棄去底部可能出現的固體沉澱，取上清；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
發酵液
10000rpm-20000rpm 離心 30-60min，（或使用 0.22μm 濾膜過濾），取上清；
液氮速凍5min，保存於-80℃。
蛇、蠍毒液等（乾重）
一般分為2種方法，可根據自身實驗條件進行選擇：
1)真空乾燥（減壓乾燥）：在低壓下，使蠍毒液中的水分快速蒸發的方法。蠍毒乾燥後，應緩緩旋開活塞，以防止空氣衝散。
蠍毒乾粉。最後在淨化條件下取出乾粉，立即分裝，密封低溫保存。
2)真空冷凍乾燥：先將蠍毒液在低溫冰櫃中預凍成固體，然後使用冷凍乾燥機進行乾燥和低溫保存。由於冷凍乾燥是在低溫和高真空度下進行的，所以毒液在凍幹過程中不起泡，不粉不沾壁、疏鬆、易取出、易溶於水、有利於保存。
樣品量要求：
血清/血漿外泌體（需要的血清/血漿初始體積）-定量蛋白組學>1ml
細胞上清外泌體（需要的細胞上清初始體積）-定量蛋白組學>50ml
蛋白鑑定篇
膠條或泳道
膠條或者泳道皆可，建議考馬斯亮藍染色（條帶清晰，無降解）；
請用EP管裝好，不用加任何保存液，用冰袋寄送即可，顏色非常淺的條帶可取多個重複樣本放一起。
蛋白溶液
如果需要跑膠，建議加loading buffer去煮；
如果不跑膠，則不用添加loading buffer。
備註：蛋白溶液需註明溶液成分和蛋白大概濃度
磁珠樣本
不要加loading buffer 去煮，直接將連著磁珠的蛋白溶液用乾冰寄送就好。
蛋白乾粉
凍幹的蛋白粉末裝入EP 管，低溫寄送
備註：以上修飾蛋白組學的樣本量僅限於磷酸化蛋白組學，關於乙醯化蛋白組學、泛素化蛋白組學、糖基化蛋白組學樣本量具體諮詢請掃描下方二維碼諮詢鹿明生物技術工程師哦~
END
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